(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010200526.X
(22)申请日 2020.03.20
(71)申请人 苏州普瑞森基因科技有限公司
地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区
星湖街218号生物纳米园A5楼505单元
(72)发明人 朱永亮 宋伟 朱浩
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
代理人 巩克栋
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
A61K 35/74(2015.01)
A61P 3/00(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
其使用方法和应用
(57)摘要
本发明提供一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌
的培养基及其使用方法和应用。所述培养基包括
脑心浸液、猪胃黏蛋白、L -半胱氨酸盐酸盐、苏氨
酸、N -乙酰-D -氨基葡萄糖和维生素。所述培养基
中添加L -半胱氨酸盐酸盐、苏氨酸、N -乙酰-D -氨
基葡萄糖和维生素，使得嗜黏蛋白阿克曼氏菌在
含有浓度较低的脑心浸液和猪胃黏蛋白的培养
基中仍然能够获得足够的营养物质，保证菌株的
蛋白阿克曼氏菌后，所得菌液的OD值为0.8211-
0.
8741。
权利要求书2页 说明书10页序列表1页 附图1页CN 111304133 A 2020.06.19
C N 111304133
A
1.一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括脑心浸液、猪胃黏蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐、苏氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和维生素。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括浓度为25-40g/L脑心浸液、1.5-6g/L猪胃黏蛋白、0.1-5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、1-10g/L苏氨酸、1-10g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖和质量分数为0.01-0.05％的维生素；
优选地，所述维生素包括维生素K1；
优选地，所述培养基以水为溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括微量元素；
优选地，所述微量元素包括锌、硼、铜、铁、钼、镍、锰或钴中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述培养基中微量元素的含量为0.05-0.15g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，含有所述微量元素的溶液包括氯化锌、硼酸、二水氯化铜、四水氯化亚铁、二水钼酸钠、六水氯化镍、四水氯化锰或六水氯化钴中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，含有所述微量元素的溶液的配方为：
0.05-0.1g/L氯化锌、0.05-0.1g/L硼酸、0.01-0.02g/L二水氯化铜、1-2g/L四水氯化亚铁、0.02-0.03g/L二水钼酸钠、0.02-0.03g/L六水氯化镍、0.05-0.15g/L四水氯化锰和0.1-0.15g/L六水氯化钴。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括表面活性剂；
优选地，所述表面活性剂包括吐温-80；
优选地，所述表面活性剂的质量分数为0.01-0.02％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括如下组分：
25-40g/L脑心浸液、1.5-5g/L猪胃黏蛋白、0.5-2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、3-10g/L苏氨酸、3-10g/L N-乙
酰-D-氨基葡萄糖、质量分数为0.01-0.02％维生素K1、0.05-0.15g/L微量元素、质量分数为0.01-0.02％吐温-80；
进一步优选地，所述培养基中包括如下组分：
27-30g/L脑心浸液、2-2.5g/L猪胃黏蛋白、1.4-1.6g/L L-半胱氨酸盐酸盐、4-6g/L苏氨酸、4-6g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、质量分数为0.014-0.016％的维生素K1、0.08-0.12g/ L微量元素、质量分数为0.014-0.016％的吐温-80。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的培养基的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
将嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌液接种于如权利要求1-6任一项所述的培养基中，进行厌氧培养。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述菌液的浓度为(0.8-1.2)×108cfu/mL；
优选地，所述菌液的接种量为100-200μL；
优选地，所述厌氧培养的温度为35-40℃；
优选地，所述厌氧培养的时间为72-96h。
9.根据权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
向权利要求1-7任一项所述的培养基中接种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌液，所述菌液的浓度为(0.8-1.2)×108cfu/mL，接种量为100-200μL，而后在35-40℃下进行厌氧培养72-96h。
10.利用如权利要求1-6所述的培养基培养得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌在制备代谢性疾病的药物中的应用。
一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基及其使用方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物培养基技术领域，具体涉及一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基及其使用方法和应用。
背景技术
[0002]嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)简称Akk菌，是一种革兰氏阴性的严格厌氧球菌。2004年，德里安教授和她的团队在人体肠道中分离得到Akk菌，在人类消化道中普遍存在，约占比3-5％，可降解人体肠道中黏蛋白，它与肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱呈负相关，具有延缓衰老、抑制神经退行性疾病、降脂减肥的作用。
[0003]肠道中低水平的Akk菌可能导致黏膜层的变薄，从而导致肠道屏障功能减弱，使肠道内的毒素更容易侵入人体。因此，Akk菌是最近几年肠道微生物研究中的明星菌。同时，Akk菌存在一些改善身体各种病症的作用，有相当多的学者都将其视为下一代的益生菌，其作为主要成分的制剂必定具有广大的发展前景和市场。
[0004]Akk菌合成培养基的优化是提高Akk菌产量必需而且至关重要的内容。目前国内外对于Akk的培养大都依赖于由牛脑心浸液琼脂干粉和猪胃黏蛋白配制而成的培养基，虽然培养的效果尚可，但是成本较高。
[0005]CN109810931A公开了一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基及其使用方法，属于微生物培养基技术领域。所述培养基的组分包括大豆蛋白胨、苏氨酸、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、氯化钠和磷酸氢二钠。采用所述培养基能够培养得到嗜黏蛋白阿克曼氏菌功能性研究所需的菌量，培养基的组分来源安全，不存在潜在的生物危险。然而利用上述培养基虽然不添加牛脑心浸液琼脂干粉和猪胃黏蛋白仍然能够培养培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，然而得到Akk菌的OD600值仍然较低。
[0006]因此，对于添加其他试剂是否更加有利于Akk菌的培养，以及降低牛脑心浸液干粉和猪胃黏蛋白的使用量，是否能达到较好的培养效果，鲜有报道。所以，开发一种利于Akk菌生长且成本较低的培养基是本领域亟需解决的问题。
发明内容
[0007]鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基及其使用方法和应用，所述培养基由多成分组成，降低了牛脑心浸液干粉和猪胃黏蛋白的使用量，并通过筛选其他组分，科学配比，所得培养基能够达到更好的培养效果。
[0008]为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本发明提供一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基，所述培养基包括脑心浸液、猪胃黏蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐、苏氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和维生素。[0010]所述培养基除脑心浸液和猪胃黏蛋白之外，还包括L-半胱氨酸盐酸盐、苏氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和维生素。其中，半胱氨酸是一种还原剂，能够消耗培养基中的氧气，有利于嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧生长。苏氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和维生素也能够提高
培养基中的碳氮含量，N-乙酰-D-氨基葡萄糖是生物体内许多重要多糖的基本组成单位，可以提供碳源，维生素作为一种生长因子，可以促进细菌的生长，均是维持菌株正常生长繁殖所需要的营养物质。
[0011]作为本发明优选的技术方案，所述培养基中包括浓度为25-40g/L脑心浸液、1.5-6g/L猪胃黏蛋白、0.1-5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、1-10g/L苏氨酸、1-10g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖和质量分数为0.01-0.05％的维生素，其中质量分数表示维生素与培养基总质量的比值。
[0012]所述培养基中各组分的浓度在上述范围中时，用于培养Akk菌效果较好，若是低于所述最低浓度，则可能导致培养基营养不足，若是高于最高浓度，则导致Akk菌生长与繁殖不协调，导致生长情况不良好。为了使菌株能正常生长发育，培养基除了必须有足够的碳、氮营养外，还应注意碳与氮的比例，这样既能保证营养生长阶段对营养的需要，也能保证生殖生长的顺利进行。
[0013]本发明中，所述培养基中脑心浸液的质量浓度为25-40g/L，例如可以是25g/L、26g/L、28g/L、30g/L、32g/L、35g/L、36g/L、38g/L或40g/L等。
[0014]所述培养基中猪胃黏蛋白的质量浓度为0.5-2g/L，例如可以是0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.8g/L或2g/L等。
[0015]所述培养基中L-半胱氨酸盐酸盐的质量浓度为0.1-5g/L，例如可以是0.1g/L、0.5g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.4g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、5.5g/L或5g/L等。[0016]所述培养基中苏氨酸的质量浓度为1-10g/L，例如可以是1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L等。
[0017]所述培养基中N-乙酰-D-氨基葡萄糖的质量浓度为1-10g/L，例如可以是1g/L、2g/ L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L等。
[0018]所述培养基中维生素的质量分数为0.01-0.05％，例如可以是0.01％、0.012％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％或0.05％等。
[0019]优选地，所述维生素包括维生素K1。
[0020]优选地，所述培养基以水为溶剂。
[0021]作为本发明优选的技术方案，所述培养基中还包括微量元素。
[0022]优选地，所述微量元素包括锌、硼、铜、铁、钼、镍、锰或钴中的任意一种或两种以上的组合。
[0023]优选地，所述培养基中微量元素的含量为0.05-0.15g/L，例如可以是0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.14g/L或0.15g/L等。
[0024]通过添加上述微量元素，能够进一步提高Akk菌的生存活力，使其在培养时生长更加具有优势。
[0025]作为本发明优选的技术方案，含有所述微量元素的溶液包括氯化锌(ZnCl2)、硼酸(H3BO3)、二水氯化铜(CuCl2·2H2O)、四水氯化亚铁(FeCl2·4H2O)、二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、六水氯化镍(NiCl2·6H2O)、四水氯化锰(MnCl2·4H2O)或六水氯化钴(CoCl2·6H2O)中的任意一种或两种以上的组合。
[0026]优选地，含有所述微量元素的溶液的配方为0.05-0.1g/L(例如可以是0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L或0.1g/L等)氯化锌、0.05-0.1g/L(例如可以是0.05g/
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