用于病毒感染的AAK1抑制剂的制作方法

用于病毒感染的aak1抑制剂
1.技术领域
1.本发明涉及病毒感染的、管控和预防以及其中有用的化合物。
2.

背景技术：

2.冠状病毒(cov)主要在鸟类和哺乳动物中引起地方性感染。在过去的数十年中，冠状病毒已经被证明同样能够感染人类。2003年爆发的严重急性呼吸综合征(sars)、中东呼吸综合征(mers)以及最近爆发的2019冠状病毒病(covid-19)已经证明了cov跨越物种屏障感染人类时的致命性。受covid-19大流行的刺激，人们对冠状病毒研究重新产生了兴趣，催生了各种新疫苗。然而，仍然迫切需要其它方法来、预防和管控病毒感染。
3.衔接因子相关激酶1(aak1)是丝氨酸/苏氨酸激酶的ark1/prk1家族的成员。aak1 mrna以称为短形式和长形式的两种剪接形式存在。长形式占优势，并且在脑和心脏中高度表达(henderson和conner,《细胞分子生物学》(mol.biol.cell).2007,18,2698-2706)。aak1富含于突触体制剂中，并且与胞吞结构共同定位在培养的细胞中。aak1调节网格蛋白包覆性胞吞(clatherin coated endocytosis)，这是突触囊泡再循环和受体介导的胞吞中很重要的一个过程。aak1与作为连接受体货物与网格蛋白包覆物的异四聚体的ap2复合物缔合。网格蛋白与aak1结合刺激了aak1激酶活性(conner等人,《运输》(traffic)2003,4,885-890；jackson等人,《细胞生物学杂志》(j.cell.biol.)2003,163,231-236)。aak1使ap-2的μ-2亚基磷酸化，这促进了μ-2与运货受体上含酪氨酸的分选基序的结合(ricotta等人,《细胞生物学杂志》2002,156,791-795；conner和schmid,《细胞生物学杂志》2002,156,921-929)。μ2磷酸化不是受体摄取所需要的，但磷酸化增强了内化效率(motely等人,《细胞分子生物学》2006,17,5298-5308)。开发aak1抑制剂的近期工作集中在它们疼痛和某些形式的精神病的潜在用途上。参见例如美国专利第9,902,722号。
3.

技术实现要素：

4.本发明基于发现某些aak1抑制剂抗病毒活性，并且可用于病毒感染。因此，本发明的一个实施方式是一种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的衔接因子相关激酶1(aak1)抑制剂。
5.在一些实施方式中，所述受试者表现出发热、咳嗽、呼吸短促、呼吸困难、持续胸痛、胸闷、唇或面发青、疲劳、流鼻涕或喉咙痛中的一种或多种。
6.本文还提供了抑制冠状病毒进入宿主细胞、在宿主细胞中组装和/或出芽的方法，所述方法包括使所述宿主细胞与aak1抑制剂接触。
7.在一些实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。在一些实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)。在一些实施方式中，所述冠状病毒是中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。
8.在一些实施方式中，冠状病毒是sars-cov-2样冠状病毒。在一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒与seq id no 1具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。
9.在一些实施方式中，冠状病毒是cov-229e样冠状病毒。在一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒与seq id no 5具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。
10.在一些实施方式中，冠状病毒是cov-oc43样冠状病毒。在一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒与seq id no 9具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。
11.在一些实施方式中，aak1抑制剂是式(i)化合物：
[0012][0013]
或其药用盐，其中：
[0014]
a选自
[0015][0016]
其中表示与b的连接点；
[0017]
b选自
[0018][0018]
其中“*”表示与r5的连接点，“**”表示与环a的连接点；
[0019]
r1选自氢、氨基、-co2h、二氟甲基、乙基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3、三氟甲氧基和三氟甲基；
[0020]
r2选自氢、氰基、-ch2oh、卤素和甲基；
[0021]
r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、甲基磺酰基、三氟甲氧基、三氟甲基、-ch2n(ch3)2以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；
[0022]
r4选自氢、卤素和甲基；
[0023]
r5选自
[0024][0025]
r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基；并且
[0026]
r7是甲基。
[0027]
在一些实施方式中，aak1抑制剂是式(ii)化合物：
[0028][0029]
或其药用盐，其中：
[0030]
a选自
[0031][0032]
其中表示与b的连接点；
[0033]
b选自苯基和吡啶基；
[0034]
r1选自氢、二氟甲基、卤素、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3和三氟甲基；
[0035]
r2选自氢、-ch2oh和卤素；
[0036]
r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、三氟甲氧基、三氟甲基以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；
[0037]
r4选自氢、卤素和甲基；并且
[0038]
r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基。
[0039]
在一些实施方式中，a是
[0040][0041]
在一些实施方式中，b是
[0042][0043]
在一些实施方式中，r5是
[0044][0045]
在一些实施方式中，aak1抑制剂是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：
[0046][0047]
或其药用盐(本文中称为“化合物1”)。
[0048]
在一些实施方式中，aak1抑制剂是以包含aak1抑制剂和药用载体或赋形剂的药物组合物的形式施用于受试者。在一些实施方式中，所述药物组合物为药物剂型。在一些实施方式中，所述施用是口服。
[0049]
本发明的一个实施方式是一种、管控和/或预防sars-cov-2样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物1或其药用盐。
[0050]
本发明的一个实施方式是一种、管控和/或预防cov-229e样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物1或其药用盐。
[0051]
本发明的一个实施方式是一种、管控和/或预防cov-oc43样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物1或其药用盐。
[0052]
在一些实施方式中，aak1抑制剂以约50-500mg的剂量口服施用于所述受试者。在一些实施方式中，aak1抑制剂以约100-300mg的剂量口服施用于所述受试者。在一些实施方式中，aak1抑制剂以约150-250mg的剂量口服施用于所述受试者。在一些实施方式中，aak1抑制剂以约200mg的剂量口服施用于所述受试者。
4.附图说明
[0053]
以下附图形成本说明书的一部分并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合对本文提供的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。
[0054]
图1示出了由测试aak1抑制剂(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺磷酸盐(“化合物1”)对cov-229e的体外抗病毒作用获得的一些原始数据。
[0055]
图2提供了由测试化合物1对cov-229e的体外抗病毒作用获得的数据的图形表示。
[0056]
图3描绘了对hcov-oc43诱导cpe的抑制作用(百分比值)。值示出了对作为病毒复制替代标志的hcov-oc43诱导cpe的抑制作用。
[0057]
图4描绘了huh-7细胞在存在测试物品时的活力(百分比值)。结果示出了6天时通过xtt测定(吸光度490nm读数)测定的细胞活力程度。数据相对于不存在测试材料时(单独的媒剂，只含0.01％ dmso的培养基)在细胞中观测到的值进行归一化。
[0058]
图5描绘了对于huh-7细胞测试物品的cc
50
值的测定(百分比值)。值表示活力百分比，估计为与单独的媒剂(只含0.01％ dmso的培养基)一起孵育的样品中观测到的活力百
分比的百分比。结果示出了一式两份数据点的平均值。将数据调节成s形函数，使用graphpad prism软件拟合具有可变斜率的归一化剂量-反应曲线来计算cc
50
值。
[0059]
图6描绘了化合物1对未感染和hcov-oc43感染的h292细胞的活力的影响。数据表示为细胞活力平均百分比
±
sem(n＝3)。
[0060]
图7描绘了hcov 229e cpe测定中化合物1的活性和细胞毒性曲线拟合。
[0061]
图8描绘了hcov oc43 cpe测定中化合物1的活性和细胞毒性曲线拟合。
[0062]
图9描绘了对sars-cov-2诱导cpe的抑制(原始rlu)。细胞活力显示为含有感染的vero e6细胞的孔在单独的媒剂或不同浓度的测试物品存在下的原始rlu值。未感染的细胞显示为模拟物。还包括10μm瑞德西韦作为阳性对照物。
[0063]
图10描绘了化合物1对活sars-cov-2诱导cpe的抑制作用(百分比值)。值示出了对作为病毒复制替代标志的sars-cov-2诱导cpe的抑制作用。数据值减去存在媒剂时在感染细胞中观测到的平均发光之后相对于在未感染细胞中观测到的rlu进行归一化。包括未感染细胞(“模拟物”)中的值以用于比较(100％抑制)。针对测试物品绘制的数据示出了一式两份实验的平均值和标准偏差。
[0064]
图11示出了通过化合物1进行sars-cov-2中和时的ic
50
值测定。值表示与未和测试物品一起孵育的样品(单独的媒剂)相比的活sars-cov-2(usa-wa1/2020)抑制百分比。结果示出了测试物品的一式两份数据点的平均值。对于未能使用graphpad prism软件调整为s型函数的数据，从抑制sars-cov-2复制达50％的浓度外推近似ic
50
值。
[0065]
图12描绘了化合物1处理后未感染的vero e6细胞的活力(百分比值)。结果示出了两天后通过celltiter glo测定(rlu)测定的细胞活力程度。数据相对于不存在测试材料(“媒剂”)时在细胞中观测到的值进行归一化。结果示出了一式两份数据点的平均值与标准偏差。
[0066]
图13示出了化合物1在vero e6细胞中的cc
50
值的测定(百分比值)。值表示活力百分比，估计为与单独的媒剂(培养基)一起孵育的样品中观测到的活力百分比的百分比。结果示出了一式两份数据点的平均值。有可能时将数据调整成s形函数，使用graphpad prism软件拟合具有可变斜率的归一化剂量-反应曲线来计算cc
50
值。
[0067]
图14描绘了化合物1的抗病毒活性。图14a示出了第4天的数据；图14b示出了第5天的数据。将接种在96孔板中的vero细胞与化合物1以100μm开始的连续稀释液(八次3倍稀释)一起孵育，用d2y98p和d2s221分别以moi 0.05和0.08进行转染。使用xlfit模型205计算ic
50
值。示出了各实验的三次重复的平均值与标准偏差。实心圆表示y轴上的化合物1的平均细胞毒性。
[0068]
图15描绘了二磷酸氯喹的抗病毒活性。图15a示出了第4天的数据；图15b示出了第5天的数据。将接种在96孔板中的vero细胞与二磷酸氯喹以100μm开始的连续稀释液(8次3倍稀释)一起孵育，用d2y98p和d2s221分别以moi 0.05和0.08进行转染。使用xlfit模型205计算ic
50
值。示出了各实验的三次重复的平均值与标准偏差。实心圆表示y轴上的二磷酸氯喹的平均细胞毒性。
[0069]
图16描绘了舒尼替尼的抗病毒活性。图16a示出了第4天的数据；图16b示出了第5天的数据。将接种在96孔板中的vero细胞与舒尼替尼以100μm开始的连续稀释液(八次3倍稀释)一起孵育，用d2y98p和d2s221分别以moi 0.05和0.08进行转染。使用xlfit模型205计
算ic
50
值。示出了各实验的三次重复的平均值与标准偏差。实心圆表示y轴上的舒尼替尼的平均细胞毒性。
[0070]
图17描绘了利巴韦林(内部测定对照物)的抗病毒活性。图17a示出了第4天的数据；图17b示出了第5天的数据。将接种在96孔板中的vero细胞与利巴韦林以100μm开始的连续稀释液(八次3倍稀释)一起孵育，用d2y98p和d2s221分别以moi 0.05和0.08进行转染。使用xlfit模型205计算ic
50
值。示出了各实验的三次重复的平均值与标准偏差。实心圆表示y轴上的利巴韦林的平均细胞毒性。
5.具体实施方式
[0071]
本发明部分基于发现某些aak1抑制剂可能在、管控和/或预防病毒感染方面有用。
[0072]
5.1定义
[0073]
在描述和要求保护公开的主题内容时，将根据下面所述的定义使用下列术语。
[0074]
除非另外指出，否则术语“管控(manage、managing和management)”包括预防已经罹患特定疾病或病症的患者复发所述疾病或病症，和/或延长已经罹患所述疾病或病症的患者保持缓解的时间。所述术语包括调节所述疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间，或者改变患者对所述疾病或病症作出反应的方式。
[0075]
除非另外指出，术语“预防(prevent、preventing和prevention)”涵盖在患者开始罹患特定疾病或病症之前采取的行动，由此抑制或减轻所述疾病或病症的严重度。换言之，所述术语涵盖预防(prophylaxis)。
[0076]
除非另外指出，化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或疾患或者与所述疾病或疾患相关的一种或多种症状或者防止其复发的量。化合物的“预防有效量”意指单独或与其它药剂组合的剂在预防疾病方面提供预防效益的量。术语“预防有效量”可以涵盖改善总体预防或提高另一种预防剂的预防功效的量。
[0077]
除非另外指出，否则化合物的“有效量”是足以在疾病或疾患或管控中提供效益或者延缓或减少与所述疾病或疾患相关的一种或多种症状的量。化合物的“有效量”意指单独或与其它疗法组合的剂在疾病或疾患或管控中提供效益的量。术语“有效量”可以涵盖改善总体、减轻或避免疾病或疾患的症状或病因，或增强另一种剂的功效的量。
[0078]
除非另外指出，术语“(treat、treating和treatment)”涵盖在患者罹患特定疾病或病症时采取的行动，由此减轻所述疾病或病症的严重度或者延迟或减缓所述疾病或病症的进展。
[0079]
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该(the)”包括复数指代物。
[0080]
除非另外指出，否则术语“约”在本文用于意指在本领域的典型公差范围内。举例来说，“约”可以理解为距平均值约2个标准偏差。在某些实施方式中，约意指
±
10％。在某些实施方式中，约意指
±
5％。当“约”存在于一系列数字或范围之前时，应理解“约”可以修饰所述系列或范围中的各个数字。
[0081]
5.2aak1抑制剂
[0082]
本发明涵盖美国专利号9,902,722公开的衔接因子相关激酶1(aak1)抑制剂的使用方法和包含其的组合物。特定化合物包括式(i)化合物：
[0083][0084]
及其药用盐，其中：
[0085]
a选自
[0086]086]
其中表示与b的连接点；
[0087]
b选自b选自其中“*”表示与r5的连接点，“**”表示与环a的连接点；
[0088]
r1选自氢、氨基、-co2h、二氟甲基、乙基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3、三氟甲氧基和三氟甲基；
[0089]
r2选自氢、氰基、-ch2oh、卤素和甲基；
[0090]
r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、甲基磺酰基、三氟甲氧基、三氟甲基、-ch2n(ch3)2以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；
[0091]
r4选自氢、卤素和甲基；
[0092]
r5选自
[0093][0094]
r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基；并且
[0095]
r7是甲基。
[0096]
在式(i)的一些实施方式中，a选自
[0097][0098]
在式(i)的一些实施方式中，b选自
[0099][0100]
在式(i)的一些实施方式中，b是
[0101][0102]
在式(i)的一些实施方式中，r5是
[0103][0104]
特定aak1抑制剂包括式(ii)化合物：
[0105][0106]
及其药用盐，其中：
[0107]
a选自
[0108][0109]
其中表示与b的连接点；
[0110]
b选自苯基和吡啶基；
[0111]
r1选自氢、二氟甲基、卤素、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3和三氟甲基；
[0112]
r2选自氢、-ch2oh和卤素；
[0113]
r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、三氟甲氧基、三氟甲基以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；
[0114]
r4选自氢、卤素和甲基；并且
[0115]
r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基。
[0116]
在式(ii)的一些实施方式中，a选自
[0117][0118]
在式(ii)的一些实施方式中，b是吡啶基。
[0119]
在式(ii)的一些实施方式中，b是：
[0120][0121]
其中表示与a的连接点，表示与氧原子的连接点。
[0122]
在式(ii)的一些实施方式中，a选自
[0123][0124]
b是
[0125][0126]
具体的aak1抑制剂包括：
[0127]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氟苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0128]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0129]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氰基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0130]
(s)-2-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-5-(2-氨基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0131]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0132]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲氧基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0133]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-甲基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0134]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氯苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0135]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3,5-二氟苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0136]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氯-5-氟苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0137]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氟-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0138]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-2,5-二氟苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0139]
(s)-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-氟苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0140]
(s)-(4-(4-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-3-(异唑-5-基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0141]
(s)-2-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-5-(2-甲基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0142]
(s)-2-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-5-(2-甲氧基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0143]
(s)-2-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-5-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苯甲腈；
[0144]
(s)-1-(2-(异唑-5-基)-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯氧基)-4-甲基戊-2-胺；
[0145]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0146]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0147]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氰基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0148]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氰基苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0149]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(二氟甲基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0150]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(二氟甲基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0151]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲氧基)苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0152]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲氧基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0153]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氟苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0154]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氟苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0155]
(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氯苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0156]
(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-甲基苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0157]
(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-2,3-二甲基苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0158]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(羟甲基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0159]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-环丙基苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0160]
(s)-n-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)-5-(羟甲基)吡啶-2-基)乙酰胺；
[0161]
(s)-1-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0162]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苯甲腈；
[0163]
(s)-1-(2-(二氟甲基)-4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0164]
(s)-1-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0165]
(s)-1-(4-(3-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0166]
(s)-1-(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0167]
(s)-1-(4-(2-氟-3-甲基吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0168]
(s)-1-(4-(2,3-二氟吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0169]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0170]
(s)-1-(4-(2-氟吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0171]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(2-甲基吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0172]
(s)-1-(4-(3-甲氧基吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0173]
(s)-1-(4-(3-氟吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0174]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(2-甲基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0175]
(s)-1-(2-环丙基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0176]
(s)-1-(2-(二氟甲基)-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0177]
(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0178]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-甲基-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0179]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-氰基-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0180]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-甲基-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0181]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-氯-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0182]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-甲氧基-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0183]
(s)-1-((2'-氯-5-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0184]
(s)-1-((2'-(二氟甲基)-5-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0185]
(s)-6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-2'-(二氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-5-甲腈；
[0186]
(s)-1-((5-氯-2'-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0187]
(s)-1-((2',5-二甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0188]
(s)-1-((5-甲氧基-2'-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0189]
(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0190]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0191]
(s)-1-((2',6-二甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0192]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-6-氯-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0193]
(s)-1-((6-氯-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0194]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0195]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0196]
(s)-2,4-二甲基-1-(2-(三氟甲基)-4-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基)苯氧基)戊-2-胺；
[0197]
(s)-1-(4-(7-氟喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0198]
(s)-1-(4-(5,7-二氟喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0199]
(s)-1-(4-(6-氟喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0200]
(s)-1-(2-环丙基-4-(喹啉-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0201]
1-(2-氯-6-氟-4-(喹啉-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0202]
(s)-1-((5-(7-氟喹啉-4-基)-3-甲基吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0203]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(5,7-二氟喹啉-4-基)烟腈；
[0204]
(s)-1-((3-氯-5-(喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0205]
(s)-1-((3-甲氧基-5-(喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0206]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(1,6-萘啶-4-基)烟腈；
[0207]
(s)-2,4-二甲基-1-((2-甲基-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)戊-2-胺；
[0208]
(s)-2,4-二甲基-1-((4-甲基-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)戊-2-胺；
[0209]
(s)-1-((2-氯-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0210]
(s)-1-(4-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0211]
(s)-1-(4-(1,6-萘啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0212]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(1,6-萘啶-4-基)苯甲腈；
[0213]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(1,5-萘啶-4-基)苯甲腈；
[0214]
(s)-1-(4-(7-氯喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0215]
(s)-4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)喹啉-7-甲腈；
[0216]
(s)-2,4-二甲基-1-(2-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯氧基)戊-2-胺；
[0217]
(s)-1-(2-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0218]
(s)-1-(4-(2-氟吡啶-4-基)-2-甲基苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0219]
(s)-1-(2-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0220]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(2-氟吡啶-4-基)苯甲腈；
[0221]
(s)-1-((2'-氟-5-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0222]
(s)-4-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-甲基吡啶-3-基)喹啉-7-甲腈；
[0223]
(s)-1-((5-氟-2'-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0224]
(s)-1-((3-氟-5-(喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0225]
(s)-4-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-氟吡啶-3-基)喹啉-7-甲腈；
[0226]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氰基苯基)-3-氟吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0227]
(s)-6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-2'-甲基-[3,4'-联吡啶]-5-甲腈；
[0228]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(7-甲基喹啉-4-基)苯甲腈；
[0229]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(3-氟-2-甲基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0230]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(喹啉-4-基)苯甲腈；
[0231]
(s)-2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(5-氟-2-甲基吡啶-4-基)苯甲腈；
[0232]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-氰基苯基)-5-氟吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0233]
(s)-1-((6-氟-2',4-二甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0234]
(5-((3-异丁基氮杂环丁-3-基)甲氧基)-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0235]
(s)-2-((2-氨基-4-甲基戊基)氧基)-5-(6-甲基哒嗪-4-基)苯甲腈；
[0236]
(s)-1-(2-(异唑-5-基)-4-(喹啉-4-基)苯氧基)-4-甲基戊-2-胺；
[0237]
(s)-4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(三氟甲基)苯基)-2-甲基烟酸；
[0238]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-((二甲基氨基)甲基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0239]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3-(甲基磺酰基)苯基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0240]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(2-甲基吡啶-4-基)-2-(甲基磺酰基)苯氧基)戊-2-胺；
[0241]
(s)-2,4-二甲基-1-(2-(甲基磺酰基)-4-(喹啉-4-基)苯氧基)戊-2-胺；
[0242]
(s)-1-(2-(二氟甲基)-4-(6-氟喹啉-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0243]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-6-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0244]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0245]
(s)-1-((6-(二氟甲基)-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0246]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0247]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0248]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0249]
(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0250]
(s)-1-((2',4-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0251]
(s)-1-((2'-(二氟甲基)-4-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0252]
(s)-1-(2-环丙基-4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0253]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(6-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0254]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(7-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0255]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0256]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0257]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(7-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0258]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(6-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0259]
((s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(6-(三氟甲基)喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0260]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(6-(三氟甲氧基)喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0261]
(s)-1-((2-氯-6-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0262]
(s)-1-((2-氯-6-(7-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0263]
(s)-1-((6-(7-氟喹啉-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0264]
(s)-1-((6-(6-氟喹啉-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0265]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(2-甲基嘧啶-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0266]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(6-甲基嘧啶-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0267]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-2'-乙基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0268]
(s)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-3'-氟-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0269]
(s)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-5'-氟-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0270]
(s)-2,4-二甲基-1-((2'-甲基-4-(三氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)戊-2-胺；
[0271]
(s)-2,4-二甲基-1-((6-(喹啉-4-基)-4-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧基)戊-2-胺；
[0272]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-(三氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0273]
(s)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0274]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-5'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0275]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-3'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0276]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(2-甲基嘧啶-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0277]
(s)-1-(2-(二氟甲基)-4-(2-甲基嘧啶-4-基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0278]
(s)-5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3'-氟-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-胺；
[0279]
(s)-1-((2'-氯-3'-氟-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0280]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5'-氟-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0281]
(s)-1-((2'-氯-5'-氟-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0282]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3'-氟-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0283]
(s)-1-((2'-氯-6-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0284]
(s)-1-((2'-氯-6-(二氟甲基)-3'-氟-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0285]
(s)-1-((6-(二氟甲基)-3'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0286]
((s)-1-((6-氯-2'-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0287]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-6-(6-甲基哒嗪-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0288]
(s)-1-((2-(二氟甲基)-6-(6-甲基哒嗪-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0289]
(r)-2,4-二甲基-1-((2'-甲基-4-(三氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)戊-2-胺；
[0290]
(r)-2,4-二甲基-1-((6-(喹啉-4-基)-4-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧基)戊-2-胺；
[0291]
(r)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-(三氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0292]
(r)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-3'-氟-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0293]
(r)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-5'-氟-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0294]
(r)-1-((2'-氯-4-(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0295]
(r)-1-((4-(二氟甲基)-2'-乙基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0296]
(r)-1-((4-(二氟甲基)-5'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
胺；
[0320]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(二氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0321]
(s)-1-((5-(7-氯喹啉-4-基)-3-(二氟甲基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0322]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(2-甲基嘧啶-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0323]
(s)-1-((2',5-双(二氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0324]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(6-氟喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0325]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0326]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0327]
(s)-1-((5-(二氟甲基)-2',3'-二甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0328]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0329]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(7-甲基喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0330]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-甲氧基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0331]
(s)-1-((2'-(二氟甲基)-4-甲氧基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0332]
(s)-(4-(4-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)萘-1-基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0333]
(s)-2,4-二甲基-1-((4-(喹啉-4-基)萘-1-基)氧基)戊-2-胺；
[0334]
(s)-(4-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)嘧啶-2-基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0335]
(s)-(4-(2-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)嘧啶-5-基)吡啶-2-基)氨基甲酸甲酯；
[0336]
(s)-2,4-二甲基-1-((2',4,6-三甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)戊-2-胺；
[0337]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4,6-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0338]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(喹唑啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0339]
(s)-1-(4-(3,6-二氢-2h-吡喃-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0340]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(2-甲基喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0341]
(s)-1-(4-(6-氯喹啉-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0342]
(s)-1-((5-(5,7-二氟喹啉-4-基)-3-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基
戊-2-胺；
[0343]
(s)-2,4-二甲基-1-((5-(喹啉-4-基)-3-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)戊-2-胺；
[0344]
(s)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(三氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0345]
(s)-2,4-二甲基-1-((2'-甲基-5-(三氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)戊-2-胺；
[0346]
(s)-1-((5-(6-氯喹啉-4-基)-3-甲基吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0347]
(s)-1-((5-(6-氟喹啉-4-基)-3-甲基吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0348]
(s)-1-((5-(5,7-二氟喹啉-4-基)-3-甲基吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0349]
(s)-1-((5-(7-氯喹啉-4-基)-3-甲基吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0350]
(s)-1-((6-(5,7-二氟喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0351]
(s)-1-((6-(7-氟喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0352]
(s)-1-((2',4-二甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0353]
(s)-1-((6-(6-氯喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0354]
(s)-1-((6-(6-氟喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0355]
(s)-1-((6-(7-氯喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0356]
(s)-1-((6-(7-氟喹啉-4-基)-4-甲基吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0357]
(s)-1-((4-氯-6-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0358]
(s)-1-((4-氯-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0359]
(s)-1-((4-氯-6-(6-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0360]
(s)-1-((4-氯-6-(喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0361]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-4-氯-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0362]
(s)-1-((4-氯-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0363]
(s)-1-((4-氯-6-(6-氯喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0364]
(s)-1-((2',4-二氯-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0365]
(s)-1-((4-氯-6-(7-氟喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0366]
(s)-1-((4-氯-6-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基)吡啶-3-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0367]
(s)-1-((4-氯-2',3'-二甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0368]
(s)-1-((5-(二氟甲基)-2'-甲基-[3,4'-联吡啶]-6-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0369]
(r)-(6-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-5-(二氟甲基)-[3,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0370]
(r)-1-((3-(二氟甲基)-5-(喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0371]
(r)-1-((3-(二氟甲基)-5-(2-甲基嘧啶-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0372]
(r)-1-((3-(二氟甲基)-5-(5,7-二氟喹啉-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0373]
(r)-1-((5-(7-氯喹啉-4-基)-3-(二氟甲基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0374]
n-(4'-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-3'-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)乙酰胺；
[0375]
(s)-1-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0376]
(s)-2,4-二甲基-1-(4-(2-甲基吡啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯氧基)戊-2-胺；
[0377]
(s)-(5-((2-氨基-2,4-二甲基戊基)氧基)-6-甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)氨基甲酸甲酯；
[0378]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0379]
(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0380]
(s)-2,4-二甲基-1-((2'-甲基-4-(三氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)戊-2-胺；
[0381]
(s)-1-((4-(二氟甲基)-3'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0382]
(s)-1-((6-(二氟甲基)-3'-氟-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0383]
(s)-1-((3-(二氟甲基)-5-(2-甲基嘧啶-4-基)吡啶-2-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；以及
[0384]
(s)-1-((4-氯-2'-甲基-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺；
[0385]
及其药用盐。
[0386]
具体的aak1抑制剂是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：
[0387][0388]
或其药用盐。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺磷酸盐。本文公开的这种和其它aak1抑制剂可以通过本领域已知的方法以及美国专利号9,902,722所述的那些方法来制备。
[0389]
5.3病毒感染
[0390]
本发明部分针对、管控和预防病毒的方法。特定的病毒感染是冠状病毒感染。
[0391]
冠状病毒是一组在哺乳动物和鸟类中导致疾病的相关病毒。在人类中，冠状病毒引起的呼吸道感染可以在轻微到致命的范围内。轻微疾病包括普通感冒的一些病例(有其它可能的病因，主要是鼻病毒)，而更致命的变种可能导致严重急性呼吸综合征(sars)、中东呼吸综合征(mers)和2019冠状病毒病(covid-19)。
[0392]
冠状病毒构成了核糖病毒域巢病毒目冠状病毒科的正冠状病毒亚科。它们是具有
正义单链rna基因组和螺旋对称核衣壳的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小在约26至32个千碱基的范围内，是rna病毒中最大的之一(参见woo等人,《病毒》.2(8):1804-1820)。它们具有从它们的表面突出的特征性棒状刺突，在电子显微照片中产生的图像让人联想到日冕，它们的名字也由此而来。
[0393]
冠状病毒首次发现于20世纪30年代，当时家养鸡的急性呼吸道感染被证明是由传染性支气管炎病毒(ibv)引起。20世纪40年代，又分离出两种动物冠状病毒，即小鼠肝炎病毒(mhv)和传染性胃肠炎病毒(tgev)。
[0394]
20世纪60年代发现了人类冠状病毒(参见kahn等人,《儿科传染病杂志》.24(11月增刊):s223-27,详述s226)。最早研究的冠状病毒来自人类普通感冒患者，后来被命名为人类冠状病毒229e和人类冠状病毒oc43(参见geller等人,《病毒》.4(11):3044-68)。此后还发现了其它人类冠状病毒，包括2003年的sars-cov、2004年的hcov nl63、2005年的hku1、2012年的mers-cov和2019年的sars-cov-2。其中大部分涉及严重呼吸道感染(参见su等人,《微生物学趋势》24(6):490-502；以及zhu等人,《新英格兰医学杂志》.382(8):727-733)。
[0395]
在本发明的一些实施方式中，所述受试者(例如，人类患者)被sars-cov2感染。在一些实施方式中，所述受试者被hcov nl63感染。在一些实施方式中，所述受试者被mers-cov感染。在一些实施方式中，所述受试者被sars-cov感染。在一些实施方式中，所述受试者被cov-229e感染。在一些实施方式中，所述受试者被cov-oc43感染。在一些实施方式中，所述受试者被cov-hku1感染。
[0396]
sars-cov-2
[0397]
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是一种导致呼吸道疾病2019冠状病毒病(covid-19)的病毒株。有时，以其临时名称“2019新型冠状病毒”(2019-ncov)提及它。sars-cov-2是一种正义单链rna病毒(参见su等人,《微生物学趋势》.24(6):490-502；以及zhu等人,《新英格兰医学杂志》.382(8):727-733)。它在人类中有传染性，世界卫生组织(who)已经将目前的covid-19大流行指定为国际关注的突发公共卫生事件(参见almeida等人,《自然》.220(5168):650；mcintosh等人,《当代微生物学和免疫学课题》(current topics in microbiology and immunology)/《微生物学和免疫学成果》(ergebnisse der mikrobiologie und).柏林,海德堡:施普林格:87；以及kahn等人,《儿科传染病杂志》.24(11月增刊):s223-27，详述s226)。据报告，该病毒通过密切接触以及经由咳嗽或打喷嚏产生的飞沫在人与人之间传播，并且被认为通过与受体血管紧张素转化酶2(ace2)结合而进入人体细胞(参见cui等人,《自然微生物学综述》.17(3):181-92；以及li等人,《科学》.309(5742):1864-68)。
[0398]
sars-cov-2毒株的全基因组序列由seq id no:1(ncbi参考序列：nc_045512.2)表示。如本文所用，术语“sars-cov-2样冠状病毒”是指与seq id no:1的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高基因组同源性的冠状病毒。
[0399]
在本发明的一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒包含与sars-cov-2的相应基因序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、
至少约99％或更高同源性的一个或多个基因。
[0400]
在一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒包含与sars-cov-2包膜基因(seq id no:2)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(包膜蛋白)的基因。
[0401]
在一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒包含与sars-cov-2膜糖蛋白基因(seq id no:3)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(膜糖蛋白)的基因。
[0402]
在一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒包含与sars-cov-2刺突糖蛋白基因(seq id no:4)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(刺突糖蛋白)的基因。
[0403]
在一些实施方式中，sars-cov-2样冠状病毒是使用任何已知的sars-cov-2检测方法，例如pcr等分子检验或抗体检验等血清学检验阳性检测到的病毒。
[0404]
5.3.1cov-229e
[0405]
人类冠状病毒229e(cov-229e)是一种感染人类和蝙蝠的冠状病毒(参见lim等人,《疾病》.4(3):26)。它是一种包膜正义单链rna病毒，通过与apn受体结合进入其宿主细胞(参见fehr等人,施普林格.1282:1-23)。连同人类冠状病毒oc43一起，它是导致普通感冒的病毒之一(参见susanna等人,《病毒学杂志》.2011年11月；85(21):11325-11337；以及gaunt等人,国际病毒分类委员会(ictv).2018年10月)。该种类是甲型冠状病毒属和杜维纳柯病毒亚属的成员。
[0406]
cov-229e毒株的全基因组序列由seq id no:5(ncbi参考序列：nc_002645.1)表示。如本文所用，术语“cov-229e样冠状病毒”是指与seq id no:5的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高基因组同源性的冠状病毒。
[0407]
在本发明的一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒包含与cov-229e的相应基因序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的一个或多个基因。
[0408]
在一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒包含与cov-229e包膜基因(seq id no:6)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(包膜蛋白)的基因。
[0409]
在一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒包含与cov-229e膜糖蛋白基因(seq id no:7)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(膜糖蛋白)的基因。
[0410]
在一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒包含与cov-229e表面糖蛋白基因(seq id no:8)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(表面糖蛋白)的基因。
[0411]
在一些实施方式中，cov-229e样冠状病毒是使用任何已知的cov-229e检测方法，例如pcr等分子检验或抗体检验等血清学检验阳性检测到的病毒。
[0412]
5.3.2cov-oc43
[0413]
人类冠状病毒oc43(hcov-oc43)是乙型冠状病毒属1型的成员，感染人和牛(参见例如lee,paul.在香港的人冠状病毒oc43的分子流行病学(论文).香港大学图书馆.doi:10.5353/th)；ncbi.nlm.nih.gov网站；以及lim等人,《疾病》.4(3):26)。感染性冠状病毒是一种包膜正义单链rna病毒，通过与n-乙酰基-9-o-乙酰神经氨酸受体结合进入其宿主细胞(参见例如li等人,《病毒学年度评论》3(1):237-261)。
[0414]
cov-oc43毒株的全基因组序列由seq id no:9(ncbi参考序列：ay391777.1)表示。如本文所用，术语“cov-oc43样冠状病毒”是指与seq id no:9的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高基因组同源性的冠状病毒。
[0415]
在本发明的一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒包含与cov-oc43的相应基因序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的一个或多个基因。
[0416]
在一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒包含与cov-oc43包膜基因(seq id no:10)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(包膜蛋白)的基因。
[0417]
在一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒包含与cov-oc43膜糖蛋白基因(seq id no:11)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(膜糖蛋白)的基因。
[0418]
在一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒包含与cov-oc43刺突表面糖蛋白基因(seq id no:12)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(刺突表面糖蛋白)的基因。
[0419]
在一些实施方式中，cov-oc43样冠状病毒是使用任何已知的cov-oc43检测方法，例如pcr等分子检验或抗体检验等血清学检验阳性检测到的病毒。
[0420]
5.3.3mers-cov
[0421]
中东呼吸综合征(mers)，又称骆驼流感(参见例如parry等人,第八例骆驼流感死亡后的旅行警报.《泰晤士报》)，是一种由mers冠状病毒(mers-cov)引起的病毒性呼吸道感
染(参见例如中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov).who网站)。症状可能在从无，到轻微，再到严重的范围内(参见例如zumla等人,《柳叶刀》386(9997):995-1007,2015)。典型症状包括发热、咳嗽、腹泻和呼吸短促。[2]在有其它健康问题的人中，该疾病通常更为严重(参见例如zumla等人,《柳叶刀》.386(9997):995-1007,2015；以及中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov).who网站)。
[0422]
mers-cov是一种被认为最初来自蝙蝠的冠状病毒。然而，人类通常在直接接触过程中或间接地从骆驼感染(中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov).who网站)。人与人之间的传播通常需要与感染者密切接触。其在医院以外的传播并不常见(zumla等人,《柳叶刀》.386(9997):995-1007,2015)。
[0423]
mers-cov毒株的全基因组序列由seq id no:13(ncbi参考序列：nc_019843.3)表示。如本文所用，术语“mers-cov样冠状病毒”是指与seq id no:13的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高基因组同源性的冠状病毒。
[0424]
在本发明的一些实施方式中，mers-cov样冠状病毒包含与mers-cov的相应基因序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的一个或多个基因。
[0425]
在一些实施方式中，mers-cov样冠状病毒包含与mers-cov包膜基因(seq id no:14)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(包膜蛋白)的基因。
[0426]
在一些实施方式中，mers-cov样冠状病毒包含与mers-cov膜蛋白基因(seq id no:15)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(膜蛋白)的基因。
[0427]
在一些实施方式中，mers-cov样冠状病毒包含与mers-cov刺突蛋白基因(seq id no:16)的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码结构蛋白(刺突蛋白)的基因。
[0428]
在一些实施方式中，mers-cov样冠状病毒是使用任何已知的mers-cov检测方法，例如pcr、rrt-pcr等分子检验或抗体检验等血清学检验在血液和呼吸道样品中阳性检测到的病毒。
[0429]
5.3.4登革病毒
[0430]
本发明还涵盖、管控和预防登革病毒感染的方法。
[0431]
登革病毒(denv)是登革热的病因。它是一种由蚊子传播的黄病毒科黄病毒属单正链rna病毒(参见例如rodenhuis-zybert等人,《细胞与分子生命科学》.67(16):2773-86,2010；以及who(2009).《登革热诊断、、预防和控制指南》,世界卫生组织.isbn978-92-4-154787-1)。已经发现该病毒的五种血清型(参见例如normile d等人,《科学》.342
(6157):415,2013；以及dwivedi等人,登革病毒的基因组学、蛋白质组学和进化(genomics,proteomics and evolution of dengue virus).《功能基因组学简介》.16(4):217-227,2017)，它们全都可以导致全谱系疾病。
[0432]
登革病毒通过感染的伊蚊属(埃及伊蚊(ae.aegypti)或白纹伊蚊(ae.albopictus))叮咬传播给人类。登革热在全球100多个国家普遍存在。世界人口的百分之四十，约30亿人，生活在有登革热风险的地区。在有风险的地区，登革热往往是疾病的主要原因。
[0433]
在一些实施方式中，登革病毒是登革病毒1。在一些实施方式中，登革病毒是登革病毒2。在一些实施方式中，登革病毒是登革病毒3。在一些实施方式中，登革病毒是登革病毒4。
[0434]
在一些实施方式中，登革病毒是登革病毒样病毒。在一些实施方式中，登革病毒样病毒包含与编码相应登革病毒蛋白的基因的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码一种或多种蛋白质的基因。
[0435]
5.3.5乙肝病毒(hbv)
[0436]
本发明还涵盖、管控和预防乙肝病毒(hbv)感染的方法。
[0437]
乙肝病毒(hbv)是一种部分双链dna病毒(参见例如ryu等人,2017,《人类病原病毒的分子病毒学》.学术出版社.247-260)，是正肝dna病毒属的一种并且是肝dna病毒科病毒的一员。这种病毒会引起乙肝病(参见例如hassan等人,2008,乙肝病毒与胰腺癌之间的关系(association between hepatitis b virus and pancreatic cancer),《临床肿瘤学杂志》,26(28):4557-62)。乙肝病毒(hbv)病毒感染引起由于所述病毒编码的蛋白质hbx的直接作用导致的许多肝细胞变化以及由于感染后细胞内活性氧(ros)大量增加导致的间接变化。
[0438]
乙肝病毒是肝dna病毒科的一员(参见例如zuckerman aj(1996).第70章：肝炎病毒.baron s等人(编).巴伦医学微生物学(第4版).德克萨斯大学医学分部.isbn 978-0-9631172-1-2)。病毒粒子称为丹氏粒(病毒体)，由外脂质包膜和由蛋白质构成的二十面体状核衣壳核心组成。核衣壳囊封病毒dna和具有类似于反转录病毒的反转录酶活性的dna聚合酶。外包膜含有参与病毒结合和进入易感细胞的嵌埋蛋白。该病毒是最小的包膜动物病毒之一，病毒体直径为42nm，但存在多形性形式，包括缺乏核心的丝状体和球形体。这些粒子不具传染性，由形成病毒体表面的一部分的脂质和蛋白质构成，所述病毒体称为表面抗原(hbsag)并且在病毒的生命周期内过量产生(参见例如howard cr,1986,肝dna病毒的生物学(the biology of hepadnaviruses),《普通病毒学杂志》67(7):1215-35)。
[0439]
在一些实施方式中，所述hbv是hbv样病毒。在一些实施方式中，hbv样病毒包含与编码相应hbv蛋白的基因的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高同源性的编码一种或多种蛋白质的基因。
[0440]
5.4药物组合物
[0441]
本发明的实施方式包括与一种或多种药用赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂一起配制的本文所述的aak1抑制剂的用途。一些实施方式包括与一种或多种药用助剂物质一起配制的aak1抑制剂的用途。特别地，aak1抑制剂可以与一种或多种药用赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂一起配制。
[0442]
在一些实施方式中，所述aak1抑制剂可以与一种或多种额外的药剂(例如抗癌剂、抗病毒剂和抗疟疾剂)组合，以制备本发明的组合物，所述组合物可以包括一种或多种药用赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂。本领域已知的任何合适的药剂都可以用作本文所述的额外的药剂。所述额外的药剂可以是例如小分子化合物、寡核苷酸、dna、rna、微rna、小干扰rna、多肽、蛋白质或其组合。
[0443]
在一些实施方式中，所述额外的药剂是冠状病毒生命周期中一个或多个步骤的抑制剂。例如，所述额外的药剂可以是病毒进入抑制剂，如小分子融合抑制剂、肽类似物或抗体。所述额外的药剂还可以是例如病毒组装抑制剂或病毒出芽抑制剂。
[0444]
在一些实施方式中，所述额外的药剂是或改善与冠状病毒感染相关的一种或多种症状，例如发热、咳嗽、呼吸短促、呼吸困难、持续胸痛、胸闷、唇或面发青、疲劳、流鼻涕或喉咙痛的药剂。
[0445]
在一些实施方式中，所述额外的药剂是或改善冠状病毒感染并发症的一种或多种症状如急性、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、急性肝衰竭、急性心脏损伤、继发感染、急性肾损伤、脓毒性休克、弥散性血管内凝血或横纹肌病的药剂。
[0446]
在一些实施方式中，所述额外的药剂是磷酸氯喹(例如，羟基氯喹)。在一些实施方式中，所述额外的药剂是非类固醇消炎药(nsaid)。
[0447]
本领域已知多种药用赋形剂。药用赋形剂已充分描述于多种出版物中，包括例如gennaro(2000),“雷明顿：药学科学与实践”；《药物剂型与药物递送系统》(1999)；以及《药用赋形剂手册》(2000)。
[0448]
药用赋形剂如媒剂、佐剂、载体或稀释剂对公众很容易获得。此外，药用助剂物质如ph调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等对公众容易获得。
[0449]
在一些实施方式中，所述aak1抑制剂是使用能够产生所期望的效果(例如，减少病毒载量，减轻与冠状病毒感染有关的一种或多种症状，增加受试者的存活率)的任何手段施用于所述受试者。因而，可以将aak1抑制剂并入多种制剂中以用于性施用。例如，所述aak1抑制剂可以通过与适当的药用载体或赋形剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
[0450]
在药物剂型中，所述aak1抑制剂可以以其药用盐的形式施用，或者主体活性剂可以单独使用或与其它药学活性化合物适当缔合以及组合使用。以下方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝不具限制性。
[0451]
在一些实施方式中，药物剂型适合口服施用。对于口服制剂，所述aak1抑制剂可以单独或与适当的添加剂组合使用以制造片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂如滑石或硬脂酸镁组合；以及在需要时与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组
合。
[0452]
包含所述aak1抑制剂的药物组合物可以通过将它们溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂如植物油或其它类似油、合成脂族酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中而配制成注射用制剂；需要时利用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
[0453]
药物组合物的实例包括溶液、悬浮液、分散剂、漱口水、喷雾、口服分散固体制剂、咀嚼胶、糖浆、糖果、凝胶、糊剂、滴眼剂、胶囊、微胶囊、片剂、迷你片剂、微片剂、团粒、多颗粒剂、微粉化颗粒剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、微颗粒剂、栓剂、洗液、软膏、酊剂或乳膏剂。在一些实施方式中，所述药物组合物呈溶液形式。在一些实施方式中，所述药物组合物呈片剂形式。
[0454]
5.5、管控和预防方法
[0455]
本发明部分针对病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的aak1抑制剂。在一些实施方式中，这些包括冠状病毒如严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2或2019-ncov)、sars-cov-2样冠状病毒、人类冠状病毒229e(cov-229e)、cov-229e样冠状病毒、人类冠状病毒oc43(cov-oc43)和cov-oc43样冠状病毒感染的方法。在一些实施方式中，这些包括登革病毒如登革病毒1、登革病毒2、登革病毒3和登革病毒4感染的方法。在一些实施方式中，这些包括hbv感染的方法。
[0456]
特定的或管控方法减轻或预防病毒感染的一种或多种症状的严重度增加。症状的实例包括发热、咳嗽、呼吸短促、呼吸困难、持续胸痛、胸闷、唇或面发青、疲劳、流鼻涕和喉咙痛。
[0457]
本发明还涵盖抑制冠状病毒进入宿主细胞、在宿主细胞中组装和/或出芽的方法，所述方法包括使所述宿主细胞与aak1抑制剂接触。在一些实施方式中，所述宿主细胞在体外。在其它实施方式中，它在体内。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂阻断冠状病毒进入宿主细胞。在一些实施方式中，冠状病毒进入宿主细胞是通过胞吞作用。在一些实施方式中，胞吞作用依赖于冠状病毒与宿主细胞表面受体的结合。在一些实施方式中，胞吞作用不依赖冠状病毒与宿主细胞表面受体的结合。
[0458]
宿主细胞的实例包括呼吸系统器官或组织细胞，如肺细胞(例如肺泡细胞)。肺细胞可以是驻留在肺或与肺有关的任何细胞。在一些实施方式中，肺细胞是肺泡上皮细胞。在一些实施方式中，肺泡上皮细胞是at2肺泡上皮细胞。
[0459]
不受理论限制，认为在本发明的一些实施方式中，所述aak1抑制剂阻断了冠状病毒结构蛋白与宿主蛋白例如网格蛋白衔接因子蛋白(ap)复合物的μ-2亚基的结合。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂与冠状病毒结构蛋白竞争结合至宿主蛋白。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂与宿主蛋白竞争结合至冠状病毒结构蛋白。在一些实施方式中，所述冠状病毒结构蛋白是冠状病毒包膜(e)蛋白。在一些实施方式中，所述冠状病毒结构蛋白是膜(m)蛋白。在一些实施方式中，所述冠状病毒结构蛋白是刺突(s)蛋白。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂阻断了一种或多种结构蛋白与宿主蛋白的结合。
[0460]
在一些实施方式中，与不存在所述aak1抑制剂时冠状病毒结构蛋白与宿主蛋白的结合相比，冠状病毒结构蛋白与宿主蛋白的结合被抑制了至少约5％、至少约10％、至少约
273；lu等人,《自然》568(7752),415-419；sewald等人,《科学》350(6260),563-567；以及munro等人,《科学》346(6210),759-763描述了基于显微镜成像的病毒生命周期检测技术。
[0469]
在一些实施方式中，与不存在所述aak1抑制剂时的冠状病毒复制水平相比，本文所述的aak1抑制剂抑制病毒复制的程度是至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。
[0470]
在一些实施方式中，与未跟所述aak1抑制剂接触的病毒感染细胞中的病毒复制水平相比，所述aak1抑制剂当与病毒感染的细胞(例如冠状病毒感染的肺细胞)接触时抑制所述细胞中的病毒复制的程度是至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。
[0471]
在另一个实施方式中，与未跟所述aak1抑制剂接触的细胞产生的感染性病毒粒子的数目相比，所述aak1抑制剂当与病毒感染的细胞(例如冠状病毒感染的肺细胞)接触时使所述感染的细胞产生的感染性病毒粒子的量减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。
[0472]
在另一个实施方式中，与未施用所述药物组合物的受试者的病毒载量相比，所述aak1抑制剂当以一次或多次剂量施用于感染冠状病毒的受试者(例如人类受试者)时使所述受试者的病毒载量减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。检测和评价冠状病毒的病毒载量的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如zou等人,《新英格兰医学杂志》2020；382:1177-1179。
[0473]
5.5.1剂量
[0474]
所述aak1抑制剂的实施方式可以以一次或多次剂量施用于受试者。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂可以以每剂约10mg至1000mg，例如每剂约10mg至20mg、约20mg至25mg、约25mg至50mg、约50mg至75mg、约75mg至100mg、约100mg至125mg、约125mg至150mg、约150mg至175mg、约175mg至200mg、约200mg至225mg、约225mg至250mg、约250mg至300mg、约300mg至350mg、约350mg至400mg、约400mg至450mg、约450mg至500mg、约500mg至750mg或约750mg至1000mg的量施用。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂以一次或多次约40mg的单剂量施用于受试者。在一些实施方式中，所述aak1抑制剂以一次或多次约200mg的单剂量施用于受试者。
[0475]
在一些实施方式中，每剂aak1抑制剂的量是根据单位体重确定的。例如，在一些实施方式中，所述aak1抑制剂可以以约0.5mg/kg至100mg/kg，例如约0.5mg/kg至1mg/kg、约1mg/kg至2mg/kg、约2mg/kg至3mg/kg、约3mg/kg至5mg/kg、约5mg/kg至7mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至15mg/kg、约15mg/kg至20mg/kg、约20mg/kg至25mg/kg、约25mg/kg至30mg/kg、约30mg/kg至40mg/kg、约40mg/kg至50mg/kg、约50mg/kg至60mg/kg、约60mg/kg至70mg/kg、约70mg/kg至80mg/kg、约80mg/kg至90mg/kg或约90mg/kg至100mg/kg或多于约100mg/kg的量施用。
[0476]
技术人员容易理解，剂量水平会随着若干不同的因素而变化，包括但不限于所施
用的具体aak1抑制剂、症状的严重度、受试者的年龄和/或体型以及受试者对副作用的易感性。本领域技术人员可通过多种手段容易地确定指定化合物的优选剂量。
[0477]
在一些实施方式中，施用多剂量的所述aak1抑制剂。所述aak1抑制剂的施用频率可以取决于多种因素中的任一种而变化，例如症状严重度等。例如，在一些实施方式中，每个月一次、每个月两次、每个月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)施用所述aak1抑制剂。如上所讨论，在一些实施方式中，连续施用所述aak1抑制剂。
[0478]
施用所述aak1抑制剂的施用持续时间可能取决于本领域技术人员已知的多种因素中的任一种(例如，患者反应、施用途径、剂型)而变化。例如，所述aak1抑制剂可以在约一天至一周、约两周至四周、约一个月至两个月、约两个月至四个月、约四个月至六个月、约六个月至八个月、约八个月至1年、约1年至2年以上的时间段内施用。
[0479]
5.5.2施用途径
[0480]
本发明的实施方式提供了使用适用于药物递送的任何可用方法和途径，包括体内(in vivo)和活体外(ex vivo)方法以及全身和局部施用途径将所述aak1抑制剂施用于患者(例如，人)的方法和组合物。
[0481]
施用途径包括口服、鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部涂覆、静脉、直肠、鼻以及其它经肠和肠胃外施用途径。施用途径可以在需要时组合，或取决于药剂和/或所期望的效果进行调节。活性剂可以以单次剂量或以多次剂量施用。
[0482]
所述aak1抑制剂的实施方式可以使用适合递送常规药物的可用常规方法和途径(包括全身或局部途径)施用于宿主。一般来说，本发明涵盖的施用途径包括但不限于经肠、肠胃外或吸入途径。
[0483]
除吸入施用以外的肠胃外施用途径包括但不限于局部、透皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内和静脉内途径。可以进行肠胃外施用以实现所述aak1抑制剂的全身或局部递送。在需要全身递送时，施用通常涉及药物制剂的侵袭性或全身吸收型局部或粘膜施用。
[0484]
所述aak1抑制剂还可以通过经肠施用递送至受试者。经肠施用途径包括但不限于口服和直肠递送。
[0485]
通过皮肤或粘膜施用所述aak1抑制剂的方法包括但不限于局部施用合适的药物制剂、透皮传递、注射和表皮施用。对于透皮传递，吸收促进剂或离子电渗入是合适的方法。离子电渗入传递可以使用市售贴片来实现，所述贴片在若干天或更长的时间段内通过电脉冲递送其产品通过未破损的皮肤。
[0486]
在一些实施方式中，所述药物组合物是口服、静脉内、皮下、硬膜外、心室内、肌肉内、腹膜内或通过吸入施用。在一些实施方式中，所述药物组合物是口服施用。
[0487]
5.5.3受试者
[0488]
适合使用本文公开的方法的受试者包括感染了本文公开的病毒或有感染风险的受试者。
[0489]
适合用本发明的实施方式的受试者包括失败的患者。如本文所用的“失败患者”(或“失败者”)一般是指未能响应之前的冠状病毒疗法(称为“无反应者”)
或起初响应于之前的疗法，但未保持住反应(称为“复发者”)的冠状病毒感染患者。之前的疗法通常可以包括用除本公开的aak1抑制剂以外的任何抗病毒剂进行。
[0490]
适合用本公开的实施方式的受试者包括临床诊断为感染了冠状病毒感染的个体。可以通过检测来自个体的样本如下呼吸道样本、上呼吸道样本(例如鼻咽)、前鼻孔样本、中鼻甲样本、口咽(op)样本、鼻中鼻甲(nmt)拭子或唾液样本中的冠状病毒rna和/或血清中有抗冠状病毒抗体来鉴定感染了冠状病毒的个体。
[0491]
在一些实施方式中，本文所述的方法还包括在施用所述药物组合物前诊断被冠状病毒感染的受试者。本领域已知的任何合适的诊断方法都可以用于本文所述的方法。例如，核酸检验如pcr、反转录pcr(rt-pct)、抗体检验如蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)和/或其它商业或非商业诊断方法都可以用于本文所述的方法。
[0492]
适合使用本文所述的方法的受试者包括有症状患者和无症状患者。有症状患者经历本文所述或本领域已知的冠状病毒感染的一种或多种症状。所述症状可以从轻微到严重。无症状患者不经历冠状病毒的任何症状或者经历冠状病毒的一种或多种轻微症状。在一些实施方式中，有症状患者需要住院。在一些实施方式中，无症状患者不需要住院。
[0493]
5.6实施例
[0494]
通过以下实施例说明本发明的具体实施方式的方面。所述实施例描述了检验至少一种本发明化合物以及已知具有抗病毒作用的化合物(例如瑞德西韦)的抗病毒活性。
[0495]
5.6.1实施例1.在mrc-5细胞中对cov-229e毒株的体外作用
[0496]
甲型冠状病毒229e(cov-229e)毒株购自atcc(目录号vr-740)，在mrc-5细胞中产生病毒母液。通过xtt四唑鎓染料测量mrc-5细胞中甲型冠状病毒229e(cov-229e)复制后对病毒诱导的细胞病变效应(cpe)和细胞活力的抑制作用。将mrc-5细胞(5
×
103个细胞/孔)接种于96孔平底组织培养板中，允许粘附过夜。与所指示的各剂一起孵育过夜后，将稀释过的测试化合物和稀释到预定滴度的病毒添加到培养板，以在感染后6天时产生85％至95％的细胞杀伤。在37℃、5％ co2下孵育六天后，通过xtt染来测量细胞活力。使用softmax pro 4.6软件在450nm和650nm下分光光度法测定细胞培养板的光学密度。使用四参数曲线拟合分析，计算病毒感染孔的cpe降低百分比和未感染药物对照物孔的细胞活力百分比，以确定ec
50
和tc
50
值。与诱导细胞死亡相比，研究产品在抑制病毒复制方面的相对有效性(tc
50
值/ec
50
值)定义为指数或选择性指数。
[0497]
图1示出了用于确定(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺磷酸盐(“化合物1”)的ec
50
和tc
50
值的代表性原始数据。图2提供了针对所述化合物获得的抗病毒数据的图形表示。如此测定所测定的化合物1的ec
50
是约2.40μm，tc
50
是5.62μm。化合物的指数是约2.34。
[0498]
此实验中针对各种其它化合物测定的抗病毒作用见表1。
[0499]
表1
[0500]
化合物ec
50
(μm)tc
50
(μm)指数瑞德西韦0.13》2.00》15.4氯喹0.491.713.49舒尼替尼0.631.322.10
化合物12.405.622.34
[0501]
5.6.2实施例2.在huh-7细胞上对cov-oc43毒株的体外作用
[0502]
使用化合物1和苹果酸舒尼替尼测试全剂量抗病毒作用。对季节性人冠状病毒(hcov)的oc43毒株进行抗冠状病毒测定。所有测试物品都以粉末形式提供。制备固体样品在100％ dmso中的30mm母液，并保存在-20℃。
[0503]
使用huh-7粘附细胞(来自一名57岁日本男子的肝细胞癌)评估测试物品对hcov-oc43的抗病毒活性。将测试物品与靶细胞一起在33℃预孵育30分钟，然后向细胞添加病毒接种物以引发感染。推定的抑制剂在病毒吸附过程中存在于细胞培养基中。然后，洗掉病毒接种物，并以与细胞一起预孵育过程中所用的相同浓度添加测试物品。将细胞与测试物品一起孵育6天，此时进行中性红摄取测定，以确定病毒诱导的细胞病变效应(cpe)的程度。使用预防cpe作为替代标志来测定测试物品的抗病毒活性。
[0504]
在相应的感染性测定的相同持续时间内平行建立细胞活力测定。通过xtt测定来测定细胞活力。
[0505]
一式两份测试样品的八种浓度(cpe测定)或九种浓度(细胞毒性测定)。3倍连续稀释从30μm(cpe)或90μm(细胞毒性)开始。使用含有0.01％ dsmo的培养基稀释测试物品。在可能时，使用graphpad prism软件测定测试物品的ec
50
(抗病毒)和cc
50
(抑制活力)值。
[0506]
为了评估对hcov(oc43毒株)的抗病毒活性，通过在存在或不存在测试物品的情况下感染huh-7细胞来进行基于cpe的抗病毒测定。感染细胞导致细胞病变效应和细胞死亡。在此测定中，使用抑制剂存在下的cpe降低作为替代标志来测定测试物品的抗病毒活性。使用中性红摄取测定来测定细胞活力。
[0507]
将huh-7细胞保持在含10％胎牛血清(fbs)的dmem(在此称为dmem10)中。将细胞以12,500个细胞/孔接种在96孔透明平底板中，在dmem10中在33℃保持24小时。感染当天，将样品在u型底板中使用含2％ fbs的dmem(在此称为dmem2)稀释3倍。以1.25倍最终浓度制备测试物品稀释液，将40μl与靶细胞一起在33℃孵育30分钟。在测试材料预孵育后，向各孔添加10μl在dmem2中制备的病毒，并且将板在33℃在含5％ co2的湿润孵育器中孵育2小时。在此时间段之后，除去病毒接种物，在33℃在含有病毒吸附阶段所用的相同浓度的测试物品的dmem2中将细胞孵育6天。测试物品、对照抑制剂、模拟物和媒剂样品的所有稀释液都稀释在含0.01％ dmso的dmem2中。
[0508]
测试物品使用连续3倍稀释一式两份地评估。对照物包括未与病毒一起孵育的细胞(“模拟感染”)、与单独的dmem2一起孵育的感染细胞(媒剂对照+0.01％ dmso)，以及无细胞的孔(以测定背景)。一些孔用5μm对冠状病毒具有广泛抗病毒活性的免疫抑制剂和抗疟疾剂氯喹(cq)进行处理。感染6天后，处理细胞，用中性红(nr)摄取测定监测细胞活力。
[0509]
感染4天和5天后在显微镜下监测病毒诱导的cpe，第6天用中性红进行染以监测细胞活力。活细胞将中性红并入其溶酶体中。摄取依赖于活细胞保持溶酶体内部的ph低于细胞质中的能力。此过程需要atp。在溶酶体内部，染料变得带电并被保留在那里。与中性红(0.033％)一起孵育3小时之后，洗涤多余的染料，然后用含有50％乙醇和1％乙酸的溶液提取被溶酶体摄取的中性红持续15分钟，以监测490nm处的吸光度。
[0510]
从所有样品减去在无细胞的孔中获得的平均信号(490nm处的吸光度)。然后，计算在感染细胞(不存在媒剂)中观测到的平均nr摄取，然后从所有样品减去，以确定对病毒诱
导的cpe的抑制作用。然后在减去在感染细胞中观测到的吸光度信号后，将数据点相对于在模拟物(未感染细胞)中观测到的平均信号进行归一化。在这种方法的情况下，未感染的细胞保持存活并以高水平摄取nr。在不存在抗病毒剂的情况下，病毒诱导的cpe会杀死感染的细胞，导致细胞培养物对nr的摄取低(0％抑制)。相比之下，与抗病毒剂cq一起孵育防止病毒诱导的cpe并导致nr摄取较高，当实现病毒复制的100％抑制时，与在未感染细胞中观测到的情况类似。
[0511]
当在3.3μm或10μm下测试时，所评估的测试物品(舒尼替尼和化合物1)部分预防病毒诱导的细胞病变效应(20至30％抑制)。抗病毒作用在30μm下消失，可能由于所观测到的这些分子在这种浓度下的化合物诱导毒性所致。相比之下，在5μm下测试的氯喹(cq)预防大部分病毒诱导cpe，细胞活力水平保持在未感染细胞(“模拟物”)中所观测的细胞活力水平的约88％。表2概括了测试物品的抗病毒和化合物诱导细胞毒性活性(ec
50
和cc
50
值)。
[0512]
表2
[0513][0514]
其中：*通过将未感染细胞(“模拟感染细胞”)中的信号除以感染细胞中的信号来计算信号/背景水平；
#
测定的c.v.计算为针对与未感染细胞中的信号相比表现出50％以上中性红摄取的所有数据点测定的c.v.值的平均值。
[0515]
未确定选择性指数，因为在任何测试浓度下都未观测到显示出50％以上抑制的抗病毒活性。与未感染细胞中的摄取(cpe测定)相比，观测到50％以上中性红摄取的一式两份数据点的信号/背景比(s/b)和平均变异系数(c.v.)。当oc43抑制或细胞活力(cc
50
)在最高测试浓度下未达到50％时，ec
50
或cc
50
值显示为大于最高测试浓度。
[0516]
对每个培养板进行感染性测定的质量控制以确定：i)信号/背景(s/b)值；ii)已知冠状病毒抑制剂(cpe测定)或已知细胞毒性剂(细胞活力测定)的抑制作用；iii)测定的变异，如通过所有数据点的变异系数(c.v.)所测量。各测定的所有对照物都符合预期。冠状病毒(包括hcov-oc43)的已知抑制剂氯喹(cq)在6天测定中有效预防了病毒诱导的cpe。xtt测定中所用的活力对照物(伊美汀)抑制细胞活力的程度超过90％。
[0517]
抗病毒测定中一式两份实验的总体变异是1.2％，活力测定中的总体变异是2.9％。此测定的信号/背景(s/b)是7倍，如比较未感染细胞中的摄取与在单独的媒剂存在下在oc43激惹的细胞中观测到的摄取所确定。活力测定的信号/背景(s/b)是15。
[0518]
在用于评价化合物诱导的细胞毒性的活力测定(xtt)中，将未感染的细胞与七种浓度的测试物品或对照抑制剂稀释液一起孵育。孵育温度和孵育持续时间反映了预防cpe测定的条件。用xtt方法评估细胞活力。在整个反应中，四唑鎓盐(xtt)被裂解为橙甲臜染料，这只发生在具有活性线粒体的活细胞中。使用扫描多孔光谱仪直接对甲臜染料进行定量。将从无细胞孔获得的背景水平从所有数据点减去。通过测量490nm处的吸光度来监测活
力程度。
[0519]
细胞毒性数据的质量控制和分析。将在无细胞孔中获得的平均信号从所有样品减去。读数值以用单独的媒剂(组织培养基)处理的未感染细胞中观测到的平均信号的百分比的形式给出。对照物还包括含有0.1％ dmso的单独媒剂。所获得的信号/背景(s/b)是15。所有活力测定中都使用伊美汀作为细胞毒性化合物对照物。当在5μm下测试时，伊美汀阻断细胞活力的程度超过90％。
[0520]
表3
[0521][0522][0523]
表3中的原始值表示在490nm处测量的吸光度，以确定中性红的摄取程度。感染的细胞在感染六天后发生广泛cpe，并显示出中性红染明显减少。示出了各测试条件的a490值。感染所有样品，但指明为“模拟物”的那些样品除外。在dmem2存在下感染显示为媒剂的样品。还示出了用氯喹(cq)处理的样品。浓度以μm示出。
[0524]
表4
[0525][0526]
表4和图3的数据示出了对huh-7细胞中hcov-oc43诱导的cpe的抑制。使用预防病
毒诱导cpe作为替代标志来测定hcov-oc43的复制程度。在单独媒剂的存在下，感染细胞中的中性红摄取程度表明对病毒诱导的cpe无抑制作用。完全抑制(100％)导致中性红摄取等于在模拟感染细胞(0.01％ dmso)中观测到的结果。为了获得抑制值，从所有值中减去不存在测试物品(“媒剂”)时感染细胞的平均吸光度(a490)，然后将所有值相对于用以表示100％抑制的针对未感染(“模拟物”)获得的那些值进行归一化。示出了各测试条件的抑制百分比。感染所有样品，但指明为“模拟物”的那些样品除外。用氯喹处理的样品显示为cq。浓度以μm示出。针对测试物品示出的数据表示一式两份实验的平均值和标准偏差。
[0527]
表5
[0528][0529]
将huh-7细胞在不同浓度的测试物品存在下或与单独的媒剂(仅培养基)一起孵育6天。对于表5中的各数据点，示出了个别原始数据(490nm处的吸光度值)。表6示出了对照样品的原始数据值，包括“无细胞”对照物(背景)、单独培养基(0.01％ dmso)或存在0.1％ dmso)，以及含细胞毒剂伊美汀(1μm或5μm)的阳性对照物。
[0530]
表6
[0531][0532]
图4示出了huh-7细胞在不同浓度的化合物1下的细胞活力。图5描述了用于确定cc
50
值的图。
[0533]
表7
[0534][0535]
表7中的值表示用测试物品进行6天处理后剩余的活力百分比。值显示为与单独的媒剂(仅培养基)一起孵育的样品中观测到的活力的百分比。将无细胞孔中观测的背景水平从所有数据点减去。数据表示一式两份实验的均值和标准偏差。表8示出了在若干种对照物，包括单独培养基(0.01％ dsmo)或在0.1％ dmso存在下，以及含细胞毒性剂伊美汀(1μm或5μm)的阳性对照物下观测到的活力百分比。
[0536]
表8
[0537][0538]
5.6.3实施例3.在h292细胞上对hcov-oc43毒株的体外作用
[0539]
通过选择适当浓度的病毒(在适当的细胞系中引起感染的病毒)，本研究评价了滴定测试物品的抗病毒或杀病毒性能。
[0540]
将h292细胞(nci-h292)接种到96孔板中以评价对hcov-oc43(乙型冠状病毒1，vr-1558
tm
)的功效。除去培养基，将各测试物品连续稀释(8点，3倍剂量滴定)，并加入到所有实验孔，将平板与各单独测试物品一起孵育30分钟。30分钟之后，以单一浓度(100
×
中值组织培养感染剂量(tcid
50
))加入病毒。在研究持续时间内，感染后一小时，向孔加入覆盖培养基。建立媒剂孔和阳性对照物孔以控制对细胞活力的任何影响。每日一次目视检查细胞有无出现任何cpe。测定持续时间是6天。
[0541]
还用相同方式测定cc
50
(半最大细胞毒性浓度)，并使平板显影，以显示不存在病毒感染时化合物对细胞的任何细胞毒性作用。
[0542]
对于各病毒和化合物组合，使用针对哺乳动物细胞存活率的mtt比测定法并计算ec
50
来测定ec
50
值。对于各细胞系，使用针对哺乳动物细胞存活率的mtt比测定法并计算cc
50
值来测定各化合物对细胞的毒性。
[0543]
使用hcov-oc43感染nci-h292细胞系。使细胞在含补充剂的生长培养基中生长至足够的数量。一旦细胞汇合后，便将它们接种到96孔平底板中。当细胞达到90％汇合时，去除培养基，向所有实验孔加入1:10连续稀释的病毒。在研究持续时间内，感染后一小时，除去病毒并且向孔加入覆盖培养基。建立媒剂孔和阳性对照物孔以控制对细胞活力的任何影响。每日一次目视检查细胞有无出现任何cpe(由细胞变圆显而易知的细胞病变效应表明感染导致细胞死亡和斑块)。
[0544]
对于hcov-oc43，目视评价各孔中的cpe以确认是否存在病毒感染，并根据reed和muench所述的方法计算tcid
50
值(参见reed等人,估计50％端点的简单方法(a simple method of estimating fifty percent endpoints).《美国流行病学杂志》第27卷,第3.1938期)。
[0545]
经测定hcov-oc43母液的tcid
50
值高到足以用于功效研究(》1
×
104tcid
50
/ml)。具体来说，hcov-oc43对h292细胞的tcid
50
是4
×
105(tcid
50
/ml)。
[0546]
在本实验中，允许h292细胞被hcov-oc43感染，在感染的对照细胞中可见细胞病变效应。在所有测试物品下都观测到对β-冠状病毒oc43的良好抗病毒活性。如图6所示，感染h292细胞的活力随着化合物1浓度增加而增加，而未感染细胞的活力没有明显变化。因此，化合物1在h292细胞中对β-冠状病毒oc43示出了明显的抗病毒作用。对氯喹、舒尼替尼和瑞德西韦观测到类似的情形。如表9所示，所有三种在h292细胞中都对β-冠状病毒oc43显示出抗病毒作用。
[0547]
表9
[0548][0549]
5.6.4实施例4.在huh7细胞和mrc-5细胞上对hcov-oc43和hcov-229e毒株的体外作用
[0550]
此研究的目标是在细胞病变效应(cpe)测定中评估测试化合物对人冠状病毒(hcov)229e和oc43的抗病毒活性。
[0551]
化合物1作为干粉提供，并在100％ dmso溶液中制备为30mm母液。参考化合物瑞德西韦由wuxi apptec提供。在八种浓度下测试化合物，进行半对数稀释，一式两份进行50％有效浓度(ec
50
)和50％细胞毒性浓度(cc
50
)测定。细胞培养物中dmso的最终浓度是0.5％。
[0552]
hcov 229e(atcc编号vr-740)和oc43(atcc编号vr-1558)获自atcc。mrc-5细胞(atcc编号ccl-171)和huh7细胞分别获自atcc和apptec。将mrc5细胞保持在补充有10％ fbs(hyclone编号sv30087.03)、1％ l-谷氨酰胺(gibco编号25030-081)、1％ neaa(gibco编号11140-050)和1％青霉素-链霉素(hyclone编号sv30010)的最低必需培养基(sigma编号m2279)中。使用补充有5％ fbs、1％ l-谷氨酰胺、1％neaa和1％青霉素-链霉素的最低必需培养基作为测定培养基。
[0553]
将huh7细胞保持在补充有10％ fbs、1％ l-谷氨酰胺、1％ neaa和1％青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(gibco编号11960-051)中。此测定所用的主要试剂是发光细胞活力测定试剂盒celltiter glo(promega编号g7573)。此测定所用的主要仪器是酶标仪synergy2(biotek)。
[0554]
在96孔板中，将细胞以适当的密度接种并在37℃和5％ co2下培养过夜。次日，将含有连续稀释的化合物的培养基(8种浓度，半对数稀释，一式两份)加入到细胞中，在37℃和5％ co2下孵育2小时。然后用病毒感染细胞。所得培养物在35℃(229e)或33℃(oc43)和5％co2下再保持3-7天，直到病毒对照物(感染病毒但未进行化合物处理的细胞)中的病毒感染显示出明显cpe。利用celltiter glo，根据制造商的手册来测量细胞活力。
[0555]
通过酶标仪synergy2(molecular device)来测量发光信号。各化合物的抗病毒活性是基于通过病毒对照物归一化的各浓度下对cpe的抑制作用来计算。
[0556]
在没有病毒感染的相同条件下平行评价化合物的细胞毒性。利用celltiter glo，根据制造商的手册来测量细胞活力。然后基于通过培养基对照(仅培养基)归一化的测试浓度下的细胞毒性来计算cc
50
值。
[0557]
化合物的抗病毒活性和细胞毒性分别表示为抑制％和细胞活力％，用下式计算：
[0558]
抑制(％)＝(原始数据
cpd-平均值
vc
)/(平均值
cc-平均值
vc
)
×
100
[0559]
细胞活力(％)＝(原始数据
cpd-平均值
mc
)/(平均值
cc-平均值
mc
)
×
100
[0560]
其中原始数据
cpd
表示化合物处理孔的值；平均值
vc
、平均值
cc
和平均值
mc
分别表示病毒对照物、细胞对照物(未感染病毒或未进行化合物处理的细胞)和培养基对照物的平均值。
[0561]
使用graphpad prism软件(第6版)并使用具有可变斜率的log(抑制剂)与反应公式计算ec
50
和cc
50
值。然后计算si(cc
50
/ec
50
)。
[0562]
抗病毒实验用参考化合物进行质量控制。瑞德西韦示出了预期抗病毒活性和对细胞活力的影响，表明实验的可靠性。测试化合物的抗病毒和细胞毒性结果概括在表9中，其中si是cc
50
/ec
50
。
[0563]
表9
[0564]
[0565]
化合物1对hcov 229e示出了抑制活性，ec
50
值是3.64μm。化合物1对mrc-5细胞示出了明显细胞毒性，cc
50
值是14.95μm。化合物1对hcov oc43示出了抑制活性，ec
50
值是6.00μm。化合物1对huh7细胞示出了明显细胞毒性，cc
50
值是13.25μm。抑制和细胞毒性曲线如图7和图8所示。
[0566]
5.6.5实施例5.在veroe6细胞上对sars-cov-2毒株的体外作用
[0567]
为了评估对sars-cov-2(usa-wa1/2020)的抗病毒活性，通过在存在或不存在测试物品的情况下感染vero e6细胞来进行基于cpe的抗病毒测定。感染两天后，细胞感染导致细胞病变效应和细胞死亡。在此测定中，使用抑制剂存在下的cpe降低作为替代标志来测定测试物品的抗病毒活性。在未感染的细胞中，使用相同的读数(celltiter-)平行测定化合物诱导的细胞活力丧失。
[0568]
将vero e6细胞保持在含10％胎牛血清(fbs)的dmem(在此称为dmem10)中。将细胞接种并孵育24小时，然后用sars-cov-2激惹。感染当天，首先将样品在不同的板中连续稀释，然后在不改变细胞培养基的情况下添加到靶细胞。将测试物品与细胞一起在37℃孵育60分钟。在此时间段之后，将病毒接种物添加到各孔，感染多重性(m.o.i.)是0.1。在湿润孵育器中在37℃感染48小时。然后，为了估计病毒诱导的cpe，将celltiter-试剂添加到细胞，并通过在酶标仪中测量相对光单位(rlu)来估计细胞活力。
[0569]
测试物品使用连续2倍稀释一式两份地评估。对照物包括未感染细胞(“模拟感染”)和仅加入媒剂的感染细胞。一些孔还用不同浓度的羟氯喹(hcq)进行处理。hcq是对冠状病毒具有广泛抗病毒活性的免疫抑制剂和抗疟疾剂。一些细胞用瑞德西韦(10μm)处理。瑞德西韦是阻断sars-cov-2的rna聚合酶的广谱抗病毒剂。
[0570]
计算在感染细胞(不存在媒剂)中观测到的平均相对光单位(rlu)，然后从所有样品减去，以确定对病毒诱导的cpe的抑制作用。然后在减去在感染细胞中观测到的吸光度信号后，将数据点相对于在未感染细胞(模拟物)中观测到的平均信号进行归一化。在此测定中，未感染的细胞保持存活并显示出高rlu水平。在不存在抗病毒剂的情况下，病毒诱导的cpe会杀死感染的细胞，导致细胞培养物中的rlu较低(0％抑制)。相比之下，与抗病毒剂hcq或瑞德西韦一起孵育防止病毒诱导的cpe，并导致与在未感染细胞中所观测类似的rlu。这些值表示对病毒复制的100％抑制。
[0571]
celltiter-glo发光细胞活力测定法是一种基于对作为代谢活性细胞指标的atp进行定量来确定培养物中的活细胞数量的均质方法。所述测定法包括将试剂直接添加到培养的细胞，并产生与atp的存在量成比例的发光信号，atp的量与培养物中存在的细胞数量直接相关。细胞毒性化合物导致较低rlu读数。
[0572]
读数值以用单独的媒剂(组织培养基)处理的未感染细胞中观测到的平均信号的百分比的形式给出。感染细胞在感染两天后发生cpe，并显示出rlu水平显著降低。如图9所示，当用化合物1处理细胞时，与媒剂对照物相比，细胞活力增加。
[0573]
还测量了对vero e6细胞中sars-cov-2(usa-wa1/2020)诱导的cpe的抑制作用。使用预防病毒诱导cpe作为替代标志来测定sars-cov-2的复制程度。在单独媒剂的存在下，感染细胞中的rlu程度表明对病毒诱导的cpe无抑制作用。完全抑制(100％)导致rlu等于在模拟感染细胞(0.01％ dmso)中观测到的结果。为了获得抑制值，从所有值中减去不存在测试物品时感染细胞的平均rlu，然后将所有值相对于用以表示100％抑制的针对未感染(“模
拟”)获得的那些值进行归一化。图10示出了化合物1和瑞德西韦对sars-cov-2诱导的cpe的抑制作用。如图11所示测定各种化合物的ic
50
值，该图提供了化合物1的数据。
[0574]
celltiter glo活力测定中vero e6细胞的活力随化合物1和hcq浓度变化的函数示于表10中。对照物(媒剂)的测量活力是100.3
±
0.7。
[0575]
表10
[0576][0577]
值表示用测试物品进行2天处理后剩余的活力百分比。值显示为与单独的媒剂一起孵育的样品中观测到的活力的百分比。数据表示一式两份实验的均值和标准偏差。下表示出了仅有培养基对照物(0.01％dmso)时观测到的活力百分比。
[0578]
如图12所示，通过以低于25μm浓度的化合物1处理或通过以所有测试浓度的hcq处理不显著改变vero e6细胞的活力。图13示出了通过vero e6细胞活力测量的化合物1的cc
50
的测定。表11概括了此实验中测试的化合物的ic
50
和cc
50
。
[0579]
表11
[0580][0581]
*
通过将未感染细胞(“模拟感染”)中的信号除以感染细胞中的信号来计算信号/背景水平；
#
测定的c.v.计算为针对与感染或未感染细胞中的信号相比分别表现出抗病毒和细胞毒性测定的50％以上celltiter glo读数的所有数据点测定的c.v.值的平均值；1不能确定ic
50
值的准确估计值，因为由于化合物1介导的细胞毒性导致剂量反应曲线不符合s形函数；2可能时用cc
50
除以ic
50
来确定选择性指数(s.i.)；n.d：未确定。
[0582]
示出了化合物1和hcq的ic
50
(抗病毒)和cc
50
(细胞毒性)值。与在单独媒剂存在下感染的细胞(cpe测定)或未感染的细胞(活力测定)相比，观测到50％以上rlu值的一式两份数据点的信号/背景比(s/b)和平均变异系数(c.v.)。当病毒抑制或细胞活力(cc
50
)在最高测试浓度下未达到50％时，ic
50
或cc
50
值显示为大于最高测试浓度。
[0583]
总而言之，当在25μm下测试时，化合物1部分预防病毒诱导的细胞病变效应。在此浓度下，培养物中的细胞活力达到了未感染细胞中观测水平的80％。然而，抗病毒作用在较高浓度下消失，大概是由于在vero e6细胞中的升高浓度下存在化合物诱导的毒性，这混淆
了化合物1预防病毒诱导的cpe的能力。相比之下，在5μm下测试的羟氯喹(hcq)或瑞德西韦(10μm)预防了大部分病毒诱导的cpe，细胞活力水平保持在与未感染细胞(“模拟物”)中观测到的水平类似的水平。
[0584]
化合物1在12.5μm和25μm下对活sars-cov-2显示出抗冠状病毒活性。然而，所述化合物的毒性特性防止了以较高浓度完全抑制sars-cov-2复制。表10概括了测试物品的抗病毒和化合物诱导细胞毒性活性(ic
50
和cc
50
值)。
[0585]
对每个培养板进行感染性测定的质量控制以确定：i)信号/背景(s/b)值；ii)已知冠状病毒抑制剂的抑制作用(cpe测定)；iii)测定的变异，如通过所有数据点的变异系数(c.v.)所测量。各测定的所有对照都符合预期。在测定中，已知sars-cov-2抑制剂羟氯喹(hcq)和瑞德西韦有效预防了病毒诱导的cpe。
[0586]
抗病毒测定中一式两份实验的总体变异是6.4％，活力测定中的总体变异是7.6％。抗病毒测定的信号/背景(s/b)是2.1倍，如比较未感染细胞中的rlu值与在单独的媒剂存在下在sars-cov-2激惹的细胞中观测到的值所确定。未确定活力测定的信号/背景(s/b)。
[0587]
5.6.6实施例6在vero76细胞上对mers-cov毒株的体外作用
[0588]
将允许病毒感染的vero 76细胞以适当浓度接种到96孔测定板中并孵育。制备测试物品的连续稀释液并加入到细胞。包括蛋白酶抑制剂m128533作为阳性对照物。然后用mers冠状病毒(emc毒株)感染细胞，或用普通培养基进行模拟感染。孵育平板直到对照物孔中出现细胞病变效应(cpe)。用显微镜(目视测定)和通过中性红染料摄取(中性红测定)读取细胞活力。
[0589]
在此实验中，化合物1抑制了病毒感染诱导的cpe，通过显微镜目视测定法测量的ec
50
是6.4μg/ml且cc
50
是22μg/ml；通过中性红测定法测量的ec
50
是5.4μg/ml且cc
50
是11μg/ml。对照物m128533抑制了病毒感染诱导的cpe，通过显微镜目视测定法测量的ec
50
是5.0μg/ml且cc
50
》100μg/ml；通过中性红测定法测量的ec
50
是5.3μg/ml且cc
50
》100μg/ml。这些结果证明化合物1对mers冠状病毒具有抗病毒作用。
[0590]
5.6.7实施例7.在hepg2 2.2.15细胞上对hbv的体外抗病毒作用
[0591]
如之前所述(参见korba等人,抑制乙肝病毒复制的化合物的细胞培养测定法(a cell culture assay for compound which inhibit hepatitis b virus replication).《抗病毒研究》15:217-228,1991；以及korba等人,使用标准化细胞培养测定法评价核苷类似物对抗乙肝病毒复制的活性(use of a standardized cell culture assay to assess activities of nucleoside analogs again hepatitis b virus replication).《抗病毒研究》19:55-70,1992)进行一次抗hbv测定，但改为使用实时qpcr(taqman)测量与从hepg2 2.2.15细胞释放的病毒体相关的细胞外hbv dna拷贝数。hepg2 2.2.15细胞系是一种含有hbv野生型毒株ayw1基因组的两个拷贝并组成性地产生高水平的hbv的稳定人肝母细胞瘤细胞系。阻断病毒复制的任何后期步骤如转录、翻译、基因组前包壳、反转录、粒子组装和释放的抗病毒化合物可以使用此细胞系来鉴定和表征。
[0592]
简而言之，将hepg2 2.2.15细胞以1.5
×
104个细胞/孔接种在96孔微量滴定板中补充有2％ fbs、380μg/ml g418、2.0mm l-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.1mm非必需氨基酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基中。仅利用内部孔来减少细胞培养过
程中观测到的“边缘效应”；外部孔填充有完全培养基以帮助减少样品蒸发。16-24小时之后，洗涤hepg2 2.2.15细胞的汇合单层，将培养基替换为含有不同浓度的测试化合物的完全培养基，一式三份。使用拉米夫定(3tc)作为阳性对照物，同时向细胞加入单独的培养基作为阴性对照物(病毒对照物，vc)。三天后，将培养基替换为含有适当稀释的测试化合物的新鲜培养基。初始施用测试化合物后六天时，收集细胞培养物上清液，用链霉蛋白酶处理，然后用于实时定量taqman qpcr测定。通过监测由于与扩增的hbv dna杂交的淬灭荧光探针分子的外核溶解降解导致的荧光信号增加来实时检测pcr扩增的hbv dna。对于各pcr扩增，使用纯化的hbv dna的稀释液同时生成标准曲线。由hbv dna水平的降低计算抗病毒活性(确定ec
50
和ec
90
值)。然后采用四唑鎓染料(mts；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑鎓；cell 96试剂，promega)摄取测定，使用相同的测定板测量细胞活力，并使用活力数据计算化合物细胞毒性(cc
50
)。选择性指数(si
50
)计算为cc
50
/ec
50
。
[0593]
二次抗hbv测定以与上述一次测定类似的方式进行；然而，在测定结束时，使用qiagen dneasy血液和组织试剂盒，按照制造商的方案处理细胞以分离总细胞内dna。然后使用分离的dna进行实时taqman qpcr测定，以测量细胞内hbv dna拷贝数的减少。此外，由于收集细胞以收集细胞内dna，因此处理单独的复制板以评估化合物细胞毒性。二次测定的结果用于确定一次测定中观测到的细胞外hbv dna拷贝数减少是否与细胞内hbv dna拷贝数伴随减少相关。二次抗hbv测定用于确认一次测定鉴定的潜在抗病毒活性，同时，可以洞悉活性化合物的作用模式。
[0594]
如表12所示，化合物1示出了对hbv的抗病毒作用，ec
50
是6.35μm，cc
50
是29.33。测试浓度范围是：化合物1＝0.001-100μm；恩替卡韦＝0.00001-1.00μm；3tc＝0.006-2μm。
[0595]
表12
[0596]
化合物ec
50
(μm)ec
90
(μm)cc
50
(μm)si
50
si
90
16.35》100.0029.335《1恩替卡韦0.00044》1.00》1.00》2,27313tc0.02827》2.00》2.00》711
[0597]
5.6.8实施例8.通过免疫染测量化合物1在vero76细胞上对登革病毒的体外抗病毒作用
[0598]
化合物1对两种登革病毒(denv)血清型2毒株(d2y98p和d2s221)的抗病毒活性通过化合物1抑制各毒株的50％病毒感染性的浓度(ic50)来量测。
[0599]
在vero细胞中进行基于细胞病变(cpe)的抑制测定。针对d2y98p和d2s221一式三份评估测试物品的八次三倍连续稀释。通过免疫染评价感染，并分别使用“仅病毒”和“仅细胞”作为0％和100％抑制来确定各测试物品的50％抑制剂量(id50)。
[0600]
一天前将vero细胞(传代26)以1
×
104个细胞/孔接种于96孔板中，并且在补充有10％ hi-fbs、1
×
p/s和2mm l-gln的mem中在37℃和5％co2下孵育过夜。
[0601]
在96孔v型底板中，在补充有2％ hi-fbs、1
×
p/s和2mm l-gln的mem中一式三份制备各测试物品的八次三倍稀释液，最后的起始浓度是100μm。然后从含有vero细胞的96孔培养板除去培养基，用50μl补充有2％ hi-fbs、1
×
p/s和2mm l-gln的新鲜mem转移50μl测试物品；将细胞在37℃孵育60
±
5分钟。然后在各孔中添加100μl在补充有2％ hi-fbs、1
×
p/s
和2mm l-gln的mem中制备的病毒；d2y98p的moi是0.05，d2s221的moi是0.08。还加入无抗体的病毒作为基线对照物，将板在37℃和5％ co2下孵育4或5天。
[0602]
在-20℃下用乙醇/甲醇将细胞固定30分钟，然后用dpbs将细胞洗涤3次，然后除去醇溶液，通过加入在1
×
dpbs中制备的5％无水脱脂牛奶(阻断缓冲液)阻断细胞30分钟。从孔中除去阻断缓冲液，向各孔加入100μl稀释的一抗4g2(1:2,000稀释于阻断缓冲液中)，室温孵育两小时。用1
×
dpbs将板洗涤三次。将二抗山羊抗小鼠igg(h+l)-hrp缀合物1:2,000稀释于阻断缓冲液中，向各孔加入100μl，室温孵育1小时。除去所述二抗，用1
×
dpbs将板洗涤三次。加入trueblue过氧化物酶底物(150μl/孔)后持续约10分钟(直到观察到斑块)。使用bioreader 6000-vα对斑块进行计数。
[0603]
将数据输入excel以计算id
50
值。使用xlfit 5插件，fit#205(levenberg-marquardt算法)，将只有病毒设置为0％功效。
[0604]
如表13所示，化合物1对登革病毒毒株d2y98p和d2s221都示出了抗病毒作用，ic
50
值分别是7.088μm和6.66μm。
[0605]
表13
[0606]
化合物d2y98p(μm)d2s221(μm)化合物17.0886.66二磷酸氯喹11.7323.72舒尼替尼5.6524.056利巴韦林(对照物)120.171.11
[0607]
在细胞毒性测定中，将vero细胞(传代24)以1
×
104个细胞/孔接种于96孔黑板中，在37℃和5％ co2下，在补充有10％ hi-fbs、1
×
p/s和2mm l-gln的mem中孵育过夜；最后一列保持无细胞以评估测定背景(背景孔)。
[0608]
在96孔v型底板中，在补充有10％ hi-fbs、1
×
p/s和2mm l-gln的mem中一式三份制备各测试物品的八次三倍稀释液，最后的起始浓度是100μm。然后从含有vero细胞的96孔黑板除去培养基，用150μl新鲜培养基转移50μl测试物品；还包括一整列“只有细胞”。在37℃将细胞孵育四天。
[0609]
从96孔黑板除去培养基，向除背景孔(各板的最后一列)外的所有孔加入100μl celltiter-试剂(promega，目录号g7570)。然后向除背景孔外的所有孔加入100μl 1
×
dpbs。使用biotek酶标仪(成像多模式酶标仪，biotek，目录号cytation 5)读取发光
[0610]
图14至图17提供了数据的图形表示。发现化合物1的cc
50
是13.51μm。
[0611]
应理解，尽管已结合本发明的详细说明对本发明进行了描述，但上述描述意在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书的范围来限定。其它方面、优点和修改在权利要求书的范围内。
[0612]
本文公开的各参考文献整体并入本文。
[0613]
seq id no:1：ncbi参考序列：nc_045512.2；严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，全基因组
[0614]
》nc_045512.2；严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，全基因组
[0615]
[0616]
[0617]
[0618]
[0619]
[0620]
[0621]
[0622][0623]
seq id no:2严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，包膜蛋白
[0624]
》nc_045512.2：26245-26472严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，全基因组
[0625][0626]
seq id no:3严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，膜糖蛋白
[0627]
》nc_045512.2：26523-27191严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，全基因组
[0628][0629]
seq id no:4严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，刺突糖蛋白
[0630]
》nc_045512.2：21563-25384严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株wuhan-hu-1，全基因组
[0631][0632]
seq id no:5：人冠状病毒229e，全基因组
[0633]
》nc_002645.1人冠状病毒229e，全基因组
[0634]
[0635]
[0636]
[0637]
[0638]
[0639]
[0640]
[0641][0642]
seq id no:6：人冠状病毒229e，包膜蛋白
[0643]
》nc_002645.1:24750-24983人冠状病毒229e，全基因组
[0644][0645]
seq id no:7：人冠状病毒229e，膜糖蛋白
[0646]
》nc_002645.1:24995-25672人冠状病毒229e，全基因组
[0647][0648]
seq id no:8：人冠状病毒229e，表面糖蛋白
[0649]
》nc_002645.1:20570-24091人冠状病毒229e，全基因组
[0650][0651]
seq id no:9：人冠状病毒oc43，全基因组
[0652]
》ay391777.1人冠状病毒oc43，全基因组
[0653]
[0654]
[0655]
[0656]
[0657]
[0658]
[0659]
[0660]
[0661][0662]
seq id no:10：人冠状病毒oc43，包膜蛋白
[0663]
》ay391777.1:28133-28387人冠状病毒oc43，全基因组
[0664][0665]
seq id no:11：人冠状病毒oc43，膜蛋白
[0666]
》ay391777.1:28402-29094人冠状病毒oc43，全基因组
[0667][0668]
seq id no:12：人冠状病毒oc43，刺突表面糖蛋白
[0669]
》ay391777.1:23644-27729人冠状病毒oc43，全基因组
[0670]

技术特征：

1.一种、管控和/或预防冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的衔接因子相关激酶1(aak1)抑制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者表现出发热、咳嗽、呼吸短促、呼吸困难、持续胸痛、胸闷、唇或面发青、疲劳、流鼻涕或喉咙痛中的一种或多种。3.一种抑制冠状病毒进入宿主细胞、在宿主细胞中组装和/或出芽的方法，所述方法包括使所述宿主细胞与aak1抑制剂接触。4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。5.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)。6.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。7.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是sars-cov-2样冠状病毒。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述sars-cov-2样冠状病毒与seq id no 1具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。9.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是cov-229e样冠状病毒。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述cov-229e样冠状病毒与seq id no 5具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。11.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述冠状病毒是cov-oc43样冠状病毒。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述cov-oc43样冠状病毒与seq id no 9具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。13.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述aak1抑制剂是式(i)化合物：或其药用盐，其中：a选自
其中表示与b的连接点；b选自其中“*”表示与r5的连接点，“**”表示与环a的连接点；r1选自氢、氨基、-co2h、二氟甲基、乙基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3、三氟甲氧基和三氟甲基；r2选自氢、氰基、-ch2oh、卤素和甲基；r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、甲基磺酰基、三氟甲氧基、三氟甲基、-ch2n(ch3)2以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；r4选自氢、卤素和甲基；r5选自r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基；并且r7是甲基。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述aak1抑制剂是式(ii)化合物：或其药用盐，其中：a选自其中表示与b的连接点；b选自苯基和吡啶基；r1选自氢、二氟甲基、卤素、甲氧基、甲基、-nhc(o)ch3、-nhco2ch3和三氟甲基；r2选自氢、-ch2oh和卤素；
r3选自氢、氰基、环丙基、二氟甲基、卤素、羟甲基、甲氧基、甲基、三氟甲氧基、三氟甲基以及含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子的五元芳族环；r4选自氢、卤素和甲基；并且r6选自氢、乙基、氟甲基、二氟甲基、甲基和三氟甲基。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中a是16.根据权利要求13或14所述的方法，其中b是17.根据权利要求13所述的方法，其中r5是18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述aak1抑制剂是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。19.根据权利要求1、2或4-18中任一项所述的方法，其中所述aak1抑制剂是以包含所述aak1抑制剂和药用载体或赋形剂的药物组合物的形式施用于所述受试者。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述药物组合物为药物剂型。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述施用是口服。22.一种、管控或预防sars-cov-2样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物，其中所述化合物是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。23.一种、管控或预防cov-229e样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物，其中所述化合物是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：
或其药用盐。24.一种、管控或预防cov-oc43样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物，其中所述化合物是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。25.一种、管控或预防mers-cov样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。26.一种、管控或预防登革病毒样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物，其中所述化合物是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。27.一种、管控或预防hbv样冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用或预防有效量的化合物，其中所述化合物是(s)-1-((2',6-双(二氟甲基)-[2,4'-联吡啶]-5-基)氧基)-2,4-二甲基戊-2-胺：或其药用盐。

技术总结

本文提供了用于、管控和/或预防冠状病毒感染、登革病毒感染或HBV病毒感染的衔接因子相关激酶1(AAK1)抑制剂。一个特定的实施方式包括向有需要的受试者施用有效量的式(I)的AAK1抑制剂。的AAK1抑制剂。的AAK1抑制剂。

技术研发人员：

苏马

受保护的技术使用者：

莱西肯医药有限公司

技术研发日：

2021.04.19

技术公布日：

2022/12/15