(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010670227.2
(22)申请日 2020.07.13
(71)申请人 华中农业大学
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山
街1号
(72)发明人 陶攀 柳月鹏 董俊花
(74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理
事务所(普通合伙) 42231
代理人 徐绍新
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12N 7/00(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
C12R 1/92(2006.01)
(54)发明名称
一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因 (57)摘要
本发明公开了一种基于CRISPR ‑Cas12a系统
动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、
J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包
含大肠杆菌复制因子CloDF13、壮观霉素耐受基
因SMR和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动
子元件的质粒骨架核酸序列。本发明还公开了该
载体的构建方法及其在噬菌体基因组编辑中的
应用。很多噬菌体通过对自身基因组DNA进行共
价化学修饰(如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高
度糖基化修饰)以耐受宿主核酸酶对其基因组的
切割，噬菌体的这种自我保护机制给基因组编辑
带来了很大障碍，本发明克服了噬菌体基因组共
价修饰的限制，实现了对噬菌体基因组的高效编
辑。权利要求书1页 说明书25页序列表23页 附图3页CN 111926030 A 2020.11.13
C N 111926030
A
1.一种基于CRISPR -Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，包含由proC启动子调控的毛螺科菌LbCas12a蛋白编码框核酸序列、由J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。
2.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。
3.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述耐受基因是壮观霉素耐受基因SMR。
4.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述载体具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO.5所示的序列具有70％以上同源性的序列。
5.一种构建权利要求1-4任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以pET28b -NLS -LbCpF1质粒为模板，PCR扩增得到由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.1所示；
2)以DS -SPCas质粒为模板，PCR扩增得到J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示；
3)以DS -SPCas质粒为模板，PCR扩增得到包含复制因子、耐受基因和proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，该序列如SEQ ID NO.3所示；
4)通过克隆方法将上述三种核酸序列片段连接在一起，得到噬菌体基因组编辑载体。
6.含有权利要求1-4任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的工程菌。
7.权利要求1-4任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体、权利要求6所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。
8.一种编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将噬菌体靶向目标区域的Spacer序列克隆到权利要求1-4任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体；
2)在线性化载体的DNA片段上拼接噬菌体突变区域和上下游同源臂，构建含有预期突变的供体质粒；
3)将1)和2)中构建的质粒共转化到宿主菌；
4)用噬菌体感染含有上述两种质粒的宿主菌，得到的重组噬菌体。
9.如权利要求8所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述噬菌体为T4噬菌体。
10.如权利要求8所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。
权 利 要 求 书1/1页CN 111926030 A
一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其
应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，其构建方法和应用。
背景技术
[0002]噬菌体无论从数量上还是种类上都被认为是地球上最丰富的物种，蕴藏着丰富的生物宝藏。近年来，噬菌体作为天然的生物材料已经被用于疫苗载体、基因载体、细菌检测、耐药菌、组织再生、能量电池等等。然而，野生型噬菌体往往不能满足各种研发需求，对噬菌体进行改造是上述研究的基本前提。传统的噬菌体基因组编辑方法效率低、操作费时、工作量大，极大的限制了噬菌体的相关研究。为此，科学家们用CRISPR-Cas系统开发了新型噬菌体基因组编辑技术。
[0003]CRISPR-Cas是细菌和古细菌的获得性免疫系统，能特异性地识别并切割噬菌体的基因组DNA，从而抵御噬菌体的侵袭。目前已经发现6种类型CRISPR-Cas系统，其中II型(CRISPR-Cas9)和V型(CRISPR-Cas12a)系统结构较为简单。基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术利用crRNA来引导SpCas9核酸酶特异地识别和切割噬菌体的基因组，产生的双链DNA切口通过同源重组与含有预期突变的供体质粒交换片段，从而将预期突变引入到噬菌体的基因组中。使用该方法可以对噬菌体的基因组进行缺失、插入和替换等操作。[0004]限制-修饰系统是细菌抵御噬菌体感染的另一道防线，它利用细菌的核酸酶切割噬菌体的基因组，而细菌自身基因组DNA通过共价修饰免受核酸酶的切割。为了抵抗细菌的限制-修饰系统，噬菌体也对自身的基因组DNA进行共价化学修饰，如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高度糖基化修饰。研究表明噬菌体基因组的共价化学修饰同样耐受Cas9的切割，这也极大地限制了CRISPR-Cas9噬菌体编辑的应用。因此，开发一种高效、便捷的噬菌体基因组编辑方法将会极大促进人类探寻噬菌体生物宝藏的效率，对疫苗、耐药菌、细菌检测、基因、组织再生、能量电池等生物医学及相关领域的研究具有很大的促进作用。
发明内容
[0005]本发明的第一个目的是开发一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，旨在克服传统噬菌体基因组编辑和CRISCR-Cas9噬菌体编辑技术的缺陷，能够高效、便捷地对噬菌体基因组进行编辑。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种构建所述噬菌体基因组编辑载体的方法。[0007]本发明的第三个目的是提供一种噬菌体基因组编辑载体的工程菌。
[0008]本发明的第四个目的是提供所述的噬菌体基因组编辑载体、以及所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。
[0009]本发明的第五个目的是提供一种编辑噬菌体基因组的方法。
[0010]为实现第一个目的，本发明利用来源于毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)
的V型CRISPR-Cas系统(LbCas12a)开发了一种高效、便捷的噬菌体编辑载体pLbCas12a，该载体包含由proC启动子调控的来源于毛螺科菌的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。
[0011]所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。
[0012]所述耐受基因是壮观霉素耐受基因SMR。
[0013]更具体地，所述噬菌体编辑载体具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO.5所示的序列具有70％以上同源性的序列。
[0014]为实现第二个目的，本发明提供的构建方法包括以下步骤：
[0015]1)以pET28b-NLS-LbCpF1质粒为模板，PCR扩增得到由proC启动子调控的LbCas12a 蛋白编码框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.1所示；
[0016]2)以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示；
[0017]3)以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到包含大肠杆菌复制因子CloDF13、壮观霉素耐受基因SMR和proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，该质粒骨架序列如SEQ ID NO.3所示；
[0018]4)通过克隆方法将上述三种核酸序列片段连接在一起，得到噬菌体基因组编辑载体(pLbCas12a)。
[0019]为实现第三个目的，将上述载体转化到大肠杆菌DH5a中，即可得到含有所述噬菌体基因组编辑载体的工程菌。
[0020]为实现第四个目的，本发明提供了所述的噬菌体基因组编辑载体、以及所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用，该应用能克服噬菌体基因组的共价化学修饰，提高噬菌体基因组的编辑效率。
[0021]为实现第五个目的，本发明进一步提供了一种编辑噬菌体基因组的方法，该方法包括以下步骤：
[0022]1)将噬菌体靶向目标区域的Spacer序列克隆到以上所述的噬菌体基因组编辑载体，得到表达特定crRNA的pLbCas12a-crRNA质粒；
[0023]2)在线性化载体DNA片段上拼接噬菌体突变区域和上下游同源臂，构建含有预期突变的供体质粒；
[0024]3)将1)和2)中构建的质粒共转化到宿主菌；
[0025]4)用噬菌体感染含有上述含有两种质粒的宿主菌，得到含有预期突变的重组噬菌体。
[0026]所述噬菌体为T4噬菌体。
[0027]优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。
[0028]本发明提供的噬菌体基因组编辑方法具有编辑效率高等优点，在疫苗载体、噬菌体、病原体检测中具有广泛的应用前景。
附图说明
[0029]图1：构建的pLbCas12a-crRNA载体工作原理示意图。
[0030]图2：当SpCas9复合物与LbCas12a复合物识别的靶区域重合时，SpCas9与LbCas12a 复合物切割T4噬菌体DNA效率的对比。图中，**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。[0031]图3：当SpCas9复合物与LbCas12a复合物识别的靶区域酶切位点重合时，SpCas9与LbCas12a复合物切割T4噬菌体DNA效率的对比。图中，**P<0.01；***P<0.001；****P< 0.0001。
[0032]图4：靶向T4噬菌体不同区域的LbCas12a-crRNA复合物之间具有协同效应。图中，* P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；★：EOP<10-7。
[0033]图5：利用pLbCas12a载体构建表达EGFP-Hoc的重组T4噬菌体的流程及鉴定结果。[0034]图6：利用pLbCas12a载体构建MiNi-T4的流程及鉴定结果。
具体实施方式
[0035]下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0036]实施例1：构建pLbCas12a质粒
[0037] 1.利用PCR技术扩增得到片段A，B和片段C：
[0038]1)用引物LbCas12a-F/LbCas12a-R，以pET28b-NLS-LbCpF1质粒为模板扩增出片段A，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。其中pET28b-NLS-LbCpF1质粒含有由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框，该质粒由美国天主教大学Venigalla Rao惠赠，质粒序列如SEQ ID NO.4所示。反应体系与扩增条件如下：[0039]片段A的PCR扩增体系：
[0040]
[0041]引物序列：
[0042]LbCas12a-F：5’-tactagaggaggaggcaaaaatgagcaaactggaaaaatttacg-3’(SEQ ID NO.6)
[0043]LbCas12a-R：5’-ctcagtgtttaaccgatgtctgtgc-3’(SEQ ID NO.7)
[0044]片段A的PCR扩增条件：
[0045]98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃1.5min，进行30个循环，72℃延伸7min。[0046]2)用引物J23100-F/J23100-R，以DS-SPCas(Addgene no.48645)为模板扩增出片段B。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。反应体系、引物序列、扩增条件如下：
[0047]片段B的PCR扩增体系：
豫公网安备41160202000603
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