(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811630558.2
(22)申请日 2018.12.21
地址 430071 湖北省武汉市武昌区小洪山
中区44号
(72)发明人 胡勤学 章牡丹
(51)Int.Cl.
C12N 7/00(2006.01)
C12N 15/63(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
A61K 39/12(2006.01)
A61P 31/14(2006.01)
(54)发明名称
性克隆的构建与应用
(57)摘要
本发明公开了一株人诺如病毒(h u m a n
norovirus，HuNoV)GII.4中国临床分离株序列及
用，该临床分离株序列和目前公开的国内外
HuNoV GII.4序列存在一定的差异，且该克隆能
够在多种真核细胞系中有效增殖，并能够产生子
代感染性的病毒粒子；灭活后的病毒粒子可以作
为HuNoV的一种新型疫苗开发研究。
权利要求书1页 说明书6页序列表12页 附图2页CN 110144331 A 2019.08.20
C N 110144331
A
1.一株人诺如病毒(HuNoV)的感染性克隆，其特征在于其基因组序列为SEQ ID No.1。
2.权利要求1所述的感染性克隆，其特征在于ORF1序列为SEQ ID No.2、ORF2序列为SEQ ID No.3、ORF3序列为SEQ ID No.4。
3.权利要求1所述的感染性克隆，其特征在于将其基因组序列的全长cDNA插入到5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr和polyA序列。
4.权利要求3所述的感染性克隆，其特征在于其可以在多种真核细胞中有效增殖。
5.权利要求4所述的感染性克隆，其特征在于可以包装出人诺如病毒子代病毒粒子。
6.权利要求1-5中任一项所述的感染性克隆，其特征在于包装出来的人诺如病毒子代病毒粒子具有感染性。
7.权利要求6所述的感染性克隆，其特征在于基因组还具有标签序列。
8.权利要求7所述的感染性克隆，其特征在于标签序列为GFP或LUC。
9.权利要求1-8任一项所述的感染性克隆的构建方法，其特征在于具有以下步骤：
1)采集人诺如病毒阳性腹泻粪便样品，并提取总mRNA；通过逆转录PCR，将所得mRNA逆转录为单链cDNA；设计HuNoV各个片段特异性扩增的PCR引物对，通过PCR扩增得到各个基因片段；
2)将扩增的HuNoV的各个片段通过overlap的方法拼接获得全长cDNA片段；
3)设计特异性针对HuNoV全长cDNA两端的PCR引物，通过PCR扩增得到各个基因片段；
4)通过overlap PCR的方法最终获得HuNoV全长cDNA片段；
5)该HuNoV全长cDNA片段两端分别引入酶切位点Afl II和Not I，将HuNoV全长cDNA片段和载体pcDNA3.1(+)分别进行双酶切，再通过T4 DNA连接酶连接酶切载体和片段，获得HuNoV全长cDNA克隆，并命名为pCMV -HuNoV；
6)在pCMV -HuNoV的3′端插入HDVr/polyA序列。
10.一种人诺如病毒的疫苗，其特征在于将权利要求1-8中任一项所述的感染性克隆包装所得的病毒粒子进行灭活后制备得到。
权 利 要 求 书1/1页CN 110144331 A
一株HuNoV GII.4临床分离株序列及其感染性克隆的构建与
应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程、生物技术领域，具体地说，本发明涉及一株人诺如病毒(HuNoV)GII.4中国临床分离株序列及其感染性克隆的构建与应用。该克隆能够在真核细胞中有效增殖并能够产生具有感染性的子代病毒粒子。
背景技术
[0002]人诺如病毒(Human Norovirus，HuNoV)是引起急性非细菌性流行肠胃炎的主要病原，常爆发在半封闭的社区如疗养院、学校、医院、巡船和救灾机构，并易感于各年龄段的人，尤其是婴幼儿、老人以及免疫受损的个体[1]，至今仍缺乏NoV疫苗。HUNoV一旦爆发就很难控制，病毒可以通过感染者呕吐
物或粪便形成的烟雾状分散的病毒粒子在人和人之间传播，大约18个病毒粒子就可以有效建立感染，并且暴露在外长达2周的病毒仍然具有感染性，且对多种常见消毒剂都有抗性[2]。HuNoV是公共卫生关注的新发病原，被划分为生物防御病原B级，迄今全球已经有26亿7千人感染，且每年有超过20万人因此死亡[3]，据估算每年花费在诺如病毒感染上的费用大概为600亿[4]，给社会公共卫生带来了很大的压力。自1968年首次从流行性肠胃炎检测出Norwalk病毒以来，越来越多的科学家投入了对HuNoV的研究。但由于诺如病毒的遗传多样性以及缺乏自然的体外培养系统及动物感染模型，至今人们对HuNoV感染性腹泻的致病机理仍然缺乏了解[5，6]。
[0003]病毒的反向遗传学是指采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。早期国外已有研究尝试构建HuNoV的反向遗传系统，并取得了一定的成功[7，8]，但是至今还没有中国株HuNoV感染性克隆的报导。我们从中国GII.4阳性腹泻样本中提取了RNA，并逆转录成cDNA，以该cDNA为模板分段扩增HuNoV序列进行测序，获得了该临床分离株的全长序列，该序列与目前国内外发布的HuNoV GII.4序列存在一定的差异；通过 overlap的方法将扩增的片段进行拼接获得全长cDNA序列，将该序列连接到 5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr/polyA序列以增加全长cDNA的转录效率。CMV启动子是人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV) 极早期启动子，可以在多种真核细胞中调控重组蛋白的高表达。HDVr是丁型肝炎病毒核酶(hepatiris delta virus ribozyme，HDVr)，可以剪切poly A后面的 RNA，有效促进插入片段的转录，而poly A是由多个腺苷一磷酸(adenosine monophosphates，AMP)组成，对mRNA的核输出、翻译及其稳定性都很重要。
发明内容
[0004]本发明的第一个目的提供一株HuNoV GII.4中国临床分离株序列，该序列与已公布的国内外HuNoV GII.4序列存在差异，对开展中国HuNoV GII.4相关研究具有重要意义。[0005]本发明的第二个目的是提供本发明所述的HuNoV GII.4中国临床分离株感染性克隆及其构建方法。
[0006]本发明的第三个目的是提供HuNoV GII.4感染性病毒粒子的灭活减毒方法。[0007]基于上述目的，一个方面，本发明提供了一株人诺如病毒(HuNoV)的感染性克隆，其特征在于其基因组序列为SEQ ID No.1。
[0008]进一步地，所述的感染性克隆的ORF1序列为SEQ ID No.2、ORF2序列为 SEQ ID No.3、ORF3序列为SEQ ID No.4。
[0009]进一步地，所述的感染性克隆的特征在于将其基因组序列的全长cDNA插入到5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr和polyA序列，其可以在多种真核细胞中有效增殖从而包装出人诺如病毒子代病毒粒子。
[0010]进一步地，所述感染性克隆包装出来的人诺如病毒子代病毒粒子具有感染性。[0011]进一步地，所述感染性克隆的基因组还具有标签序列，优选地，标签序列为GFP或LUC。
[0012]另一方面，本发明所述的HuNoV GII.4中国临床分离株序列来源于GII.4 阳性腹泻粪便样品中的基因组序列，序列获得的方法如下：
[0013] 1.采集GII.4阳性腹泻粪便样品，并提取总mRNA；
[0014] 2.通过逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)技术，将所得mRNA 逆转录为单链cDNA；
[0015] 3.设计HuNoV GII.4各个片段(片段上下游序列部分重叠)特异性扩增的 PCR引物对，通过PCR扩增得到各个基因片段；
[0016] 4.将各个基因片段送生物公司测序，获得各片段序列；
[0017] 5.将获得的各片段序列进行拼接，分析获得HuNoV GII.4全长cDNA序列。[0018]另一方面，本发明所述的HuNoV GII.4中国临床分离株感染性克隆的构建方法，如下：
[0019] 1.将上述扩增的HuNoV的各个片段通过overlap的方法拼接获得全长 cDNA片段；[0020] 2.设计特异性针对HuNoV GII.4全长cDNA两端的PCR引物(通过引物对在该全长cDNA两端分别引入酶切位点Afl II和Not I)及上述已合成的各片段的引物对(片段上下游序列部分重叠)，通过PCR扩增得到各个基因片段；
[0021] 3.通过overlap PCR的方法最终获得HuNoV GII.4全长cDNA片段；
[0022] 4.该HuNoV GII.4全长cDNA片段两端分别引入酶切位点Afl II和Not I，将HuNoV GII.4全长cDNA片段和载体pcDNA3.1(+)分别进行双酶切，再通过 T4 DNA连接酶连接酶切载体和片段，获得HuNoV GII.4全长cDNA克隆，并命名为pCMV-HuNoV；
[0023] 5.通过融合的方法，在pCMV-HuNoV的3′端插入HDVr/polyA序列以增加全长cDNA的转录效率。
[0024]另一方面，本发明所述的HuNoV GII.4感染性病毒粒子的灭活减毒方法，如下：[0025] 1.紫外灭活
[0026]将10μg HuNoV质粒转染真核细胞C，3天后收集细胞上清；1200rpm，离心5min，取上清；将上清用0.22μM滤器过滤；取病毒上清，紫外室温灭活 30min。
[0027] 2.高温灭活
[0028]收集病毒上清液的方法同上，将病毒上清液60℃高温灭活30min。
[0029] 3.化学灭活
[0030]收集病毒上清液的方法同上，将病毒上清液用20U/mL benzonase(全能核酸酶，能降解所有形式(包括单链、双链、线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性)，37℃消化24h；用1.5％(v/v)二乙烯亚胺，37℃处理6h；再加入150mM硫代硫酸钠水解未反应的乙烯亚胺，获得失去感染性的HuNoV病毒。
[0031]本发明的感染性克隆有以下几个优点：
[0032] 1.该克隆是目前第一个中国HuNoV GII.4的感染性克隆，且该克隆序列是来源于HuNoV GII.4中国临床分离株，具有重要的临床指导意义；
[0033] 2.该克隆的构建方法简单易行，且该克隆可在多种真核细胞中有效复制，并产生感染性病毒粒子。
[0034] 3.该克隆产生的感染性病毒粒子可以用来开展HuNoV感染相关研究，研究结果将比早期已发表的用HuNoV阳性粪便样品直接感染所取得的结果可信度更高。此外，对于HuNoV不敏感的一些真核细胞的研究，可在转染水平开展相关的研究，在一定程度上解决了HuNoV缺乏细胞培养系统的难题。
[0035] 4.该克隆产生的感染性病毒粒子可以用来开展HuNoV致病机理的相关研究，且可用来研发HuNoV相关疫苗，对控制和HuNoV感染性腹泻具有重要的意义。
附图说明
[0036]图1：HuNoV GII.4感染性克隆表达框的模式图，在CMV启动子的调控下表达，3′端的HDVr/polyA序列增加全长cDNA的转录效率。
[0037]图2：HuNoV GII.4感染性克隆转染真核细胞A、B、C后病毒基因可以有效复制，且在真核细胞C中的复制水平高于细胞A和B；HuNoV GII.4感染性克隆转染真核细胞C后随时间的延长基因的复制水平增加。
[0038]图3：HuNoV GII.4感染性克隆转染真核细胞C后细胞上清中能够产生子代病毒粒子。箭头所指的即为病毒粒子。
[0039]图4：HuNoV GII.4感染性克隆转染真核细胞C后，细胞上清中的病毒再感染真核细胞C后病毒RNA仍然可以进行复制。
[0040]图5：HuNoV GII.4感染性克隆转染真核细胞C后，细胞上清中的病毒再感染真核细胞C后病毒RNA可以进行复制并形成中间产物dsRNA。
具体实施方式
[0041]下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0042]在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0043]发明所述的HuNoV GII.4中国临床分离株序列来源于中国GII.4阳性腹泻粪便样品中的基因组序列，序列获得的方法如下：
[0044] 1.采集GII.4阳性腹泻粪便样品，并提取总mRNA；
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