(10)申请公布号 CN 102925486 A
(43)申请公布日 2013.02.13C N 102925486 A
*CN102925486A*
(21)申请号 201210270504.6
(22)申请日 2012.08.01
201110440750.7 2011.12.26 CN
C12N 15/866(2006.01)
C12N 15/34(2006.01)
C12N 7/01(2006.01)
C07K 14/01(2006.01)A61K 39/12(2006.01)A61P 31/20(2006.01)C12R 1/93(2006.01)
(71)申请人武汉中博生物股份有限公司
地址430070 湖北省武汉市东湖开发区
(72)发明人朱薇 熊媛媛 漆世华 张萍
秦红刚 李伟 廖园园 谢红玲
温文生 王桢桢 靖志强 吴玉石
韩兴 刘洁
(74)专利代理机构北京智汇东方知识产权代理
事务所(普通合伙) 11391
代理人康正德
范晓斌
(54)发明名称
法和其应用
(57)摘要
本发明涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗
双启动子（多角体蛋白启动子和P10启动子），可
表达双拷贝的Cap 蛋白编码基因，显著提高了蛋
白的表达效率。并且，插入的外源基因所表达的
Cap 蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒
（VLPs ），提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗
原含量高。本发明的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，
显著提高了猪圆环病毒2型亚单位疫苗的蛋白产
率及质量，所制得的疫苗组合物具有免疫效果稳
定、持久、安全性高等优点。(66)本国优先权数据
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书11页序列表3页 附图4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 11 页序列表 3 页 附图 4 页
1.一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dua1转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2，更优选所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1-2任一项所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dua1-2ORF2。
4.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤：
（1）获得如权利要求1-5任一项所述的重组杆状病毒转移载体；
（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；
（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac 中，产生重组杆状病毒DNA。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA转染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。
7.一种重组杆状病毒，由权利要求4-6任一项所述的方法制备得到，优选所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。
8.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）获得权利要求9所述的重组杆状病毒；
（2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒； （3）灭活病毒；
（4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白；
（5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（1）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，生物反应器的培养参数设定为：pH6.0-6.5、温度25-30℃、溶氧30-80%、搅拌速度50-250rpm，优选生物反应器的培养参数设定为pH6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。
11.如权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大的培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。
12.如权利要求8-11任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合进行培养，优选为分批补料培养方法进行培养。
13.如权利要求8-12任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）包括向细胞培养液中加入BEI灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。
14.如权利要求8-13任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包括收集步骤（3）灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清。
15.如权利要求8-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）包括对步骤（4）纯化的重组PCV2 Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。
16.如权利要求8-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗包括不低于8μg/ml的重组PCV2 Cap蛋白，优选所述的亚单位疫苗还包括适量的防腐剂。
17.如权利要求8-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗还包括免疫刺激复合物或Quil A皂苷的任一种，其中，所述免疫刺激复合物由Quil A皂苷、胆固醇和磷脂组成，其中，Quil A皂苷：胆固醇：磷脂的质量比为1:1:1；优选所述的亚单位疫苗还包括适量的佐剂，更优选所述佐剂选自水性佐剂、油性佐剂、纳米佐剂或缓释佐剂的任一种或其组合，还优选所述的水性佐剂选自氢氧化铝胶佐剂、赛比克Gel 01ST佐剂或Carbopol 971P NF佐剂的任一种或其组合。
18.如权利要求8-17任一项所述的制备方法，其特征在于，每头份所述的亚单位疫苗包括：不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml QuilA皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/ml Quil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。
19.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，利用权利要求7所述重组杆状病毒制得，或者如权利要求8-18任一项所述的方法制备得到。
20.如权利要求19所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其特征在于，每头份所述疫苗组合物的组成包括，不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂
、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/mlQuil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。
21.权利要求1-3任一项所述的重组杆状病毒转移载体或者权利要求7所述重组杆状病毒在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用，优选所述的PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗用于预防由猪圆环病毒2型感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。
一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。自1991年在加拿大猪中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。PCV2不但可以引发断奶仔猪多系统的衰竭，还能够使感染猪的
免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，引起继发感染，加重病情。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近年来，我国猪也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。
[0003] 疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段。目前，国内生产的疫苗为全病毒灭活疫苗，如文献CN101240264A公开了一种全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增殖能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。文献CN101180406A、CN101884787A和CN101358182A均公开了用重组杆状病毒表达PCV2 ORF2基因编码的Cap蛋白，并将其用于制备PCV2疫苗，其中，所描述的重组杆状病毒都只含有一个启动子，且未优化其生产工艺条件，致使生产获得的病毒蛋白产率及质量均较低，且所表达的目的基因有其它多余序列（如6×His标签、分泌性信号肽等）的修饰，不利于表达的外源蛋白形成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），这些重组杆状病毒构建技术策略存在表达的目的蛋白免疫原性部分丧失的缺陷。此外，由于该亚单位疫苗的佐剂和免疫刺激物等因素影响，其实践中的免疫效果并不佳。因此，急需研制一种产率更高、免疫原性及免疫效果更佳的PCV2亚单位疫苗及其制备方法和其所制备的疫苗组合物。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dual转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2。
[0005] 在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2。
[0006] 在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007] 在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。
[0008] 在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dual-2ORF2。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤：
[0010] （1）获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2ORF2；
[0011] （2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；
[0012] （3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。
[0013] 在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。
[0014] 在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种重组杆状病毒，由本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法制得。
[0016] 在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0018] （1）获得本发明制备的重组杆状病毒；
[0019] （2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒；
[0020] （3）灭活病毒；
[0021] （4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白；
[0022] （5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。
[0023] 在本发明的一个优选技术方案中，所述的步骤（2）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（1）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。
[0024] 在本发明的一个优选技术方案中，所述生物反应器的培养参数设定为：pH6.0-6.5，温度25-30℃，溶氧30-80%，搅拌速度50-250rpm，优选所述生物反应器的培养参数设定为pH6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。
[0025] 在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。
[0026] 在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合。
[0027] 在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）采用分批补料培养方法。[0028] 在本发明的一
个优选技术方案中，所述步骤（3）包括向细胞培养液中加入二乙烯亚胺（BEI）灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并可选的，在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。
[0029] 在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（4）包括收集步骤（3）灭活后的细胞
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