(10)申请公布号 CN 102236019 A
(43)申请公布日 2011.11.09C N 102236019 A
*CN102236019A*
(21)申请号 201010153717.1
(22)申请日 2010.04.23
G01N 33/569(2006.01)
G01N 33/535(2006.01)
(71)申请人陈文刚
地址300457 天津市滨海新区国际生物医药
联合研究院S604
(72)发明人陈文刚 董志珍 王涛
(54)发明名称
剂盒
(57)摘要
本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒抗
体的间接ELISA 试剂盒及其用途，属于生物技术
领域。试剂盒采用原核表达的重组P54蛋白作为
包被抗原，依据间接ELISA 原理检测猪血清中非
洲猪瘟病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗
原为原核表达的重组P54蛋白，其具有良好的抗
原性。本发明提供的酶联免疫试剂盒包括P54蛋
白包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧
化酶标记的兔抗猪IgG 多克隆抗体、浓缩洗涤液、
血清稀释液、TMB 底物、终止液。本发明试剂盒可
用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以
工作液的形式提供，使用方便。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 6 页
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ELISA法检测非洲猪瘟病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显液、终止液、阳性对照、阴性对照。
3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，
所述ELISA板条：每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P54蛋白，规格为8孔×12条；
所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；
所述底物显液：即用型TMB显液，50mL；
所述终止液：2mol/L的H
2SO
4
溶液，50mL；
所述酶标单克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
阳性对照；
阴性对照。
4.权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺，其特征在于：
采用辛酸-硫酸铵法纯化猪血清IgG，制备纯化的猪IgG，并用此纯化IgG免疫家兔，制备兔抗猪IgG多克隆抗体；采用过碘酸钠法对上述多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记。
5.权利要求1所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用。
一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA试剂盒
技术领域
[0001] 本发明为检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途。
背景技术
[0002] 非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fever：a reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，25：39～69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。[0003] 本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。
[0004] 非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。
[0005] 非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J]. Virology，1995，208：249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)：42～43)。[0006] 非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性，其中P54蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一。
[0007] ASFV P54蛋白是由E183L基因编码的，约25kD的多肽，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处。P54蛋白可以在体外培养，并能感染细胞。而且在感染细胞后在内质网膜处短暂表达。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时起着十分重要的作用(Rodriguez JM，Garcia EscuderoAfrican Swine Fever Virus
Structural Protein p54 Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors toAssembly Sites.Journal of Virology，2004，78(8)：4299～4313)。另外ASFV P54蛋白与8kD的轻链细胞质动力
蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中起重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱噬作用(AlonsoC，J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding to Light-Chain Dynein. Journal ofVirology 2001，75：9819～9827)。为了分析结构蛋白P54在细胞脱噬中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G将其在非洲绿猴肾细胞内短暂表达，实验表明可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用(Hernaez B，Diaz Gil G The African swine fever virus dynein-binding protein p54 induces infected cellapoptosis.FEBS Letters 2004，569(123)：224～228)。但P54的突变体缺失13aa而失去激活细胞凋亡蛋白酶的功能(Alejo A，GAndrés，ML Salas.African Swine Fever Virus Proteinase Is Essential for Core Maturation andInfectivity Journal of Virology，2003，77：5571～557)。
发明内容
[0008] 本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查。
[0009] 本发明还提供了一种P54基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。
[0010] 本发明还提供了一种兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。
[0011] 本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
[0012] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
[0013] 还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显液、终止液、阳性对照、阴性对照。
[0014] 上述用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒包括：
[0015] 所述ELISA板条：每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P54蛋白，规格为8孔×12条；
[0016] 所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；
[0017] 所述底物显液：即用型TMB显液，50mL；
[0018] 所述终止液：2mol/L的H2SO4溶液，50mL；
[0019] 所述酶标多克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
[0020] 阳性对照；
[0021] 阴性对照。
[0022] 所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。
[0023]
[0024]
具体实施方式
[0025] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
[0026] 本发明的技术方案如下：
[0027] 一、抗原制备
[0028] 1.非洲猪瘟P54蛋白的表达
[0029] 根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)P54基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从ASFV DN
A中扩增出P54基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P54，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
[0030] 设计的引物为：
[0031] P54-1-5’-GCGGATCCCATTATTATCATCGTT-3’
[0032] P54-2-5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’
[0033] 下划线部分为引入的酶切位点，P54-1为ASFV P54基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHIP54-2为ASFV P54基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI。[0034] 2.非洲猪瘟P54蛋白的纯化。
[0035] 诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD值见表1。纯化后P54蛋白的OD值为1.583，与标准品比较后，其浓度为900μg/ml。
[0036] 表1BCA法测定标准品蛋白含量
[0037]
A(μg/ml) B(μg/ml) C(μg/ml) D(μg/ml) E(μg/ml) F(μg/ml) G(μg/ml) H(μg/ml) 0(μg/ml)
样品
名称
浓度 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0
OD值 2.6894 2.2378 1.6493 1.3278 1.0414 0.6454 0.4062 0.1893 0.1251 [0038] 二、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG的制备
[0039] 1.纯化猪IgG的制备
[0040] 取经检验合格的肥育猪作为采血用猪，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉与动脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。[0041] 取1份预处理过的血清加2份0.06mol/L pH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调pH 至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2；在4℃
下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS 中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
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