(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910867009.5
(22)申请日 2019.09.12
(71)申请人 广东菲鹏生物有限公司
地址 523000 广东省东莞市松山湖高新技
术产业开发区花莲路5号1号厂房7楼
(72)发明人 周猛冲 章瑞程 林钰琼 黄杏帆
范国来
(74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务
所(特殊普通合伙) 11463
代理人 徐乐
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6876(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，提
用在PCR预混液中添加稳定处方实现PCR预混液
的冻干，稳定处方组分简单，冻干成品成型良好，
稳定期长，
权利要求书1页 说明书9页序列表1页CN 112481365 A 2021.03.12
C N 112481365
A
1.一种用于冻干PCR预混液的稳定处方，其特征在于，所述稳定处方包括如下a)-c)任一种组成：
b)氢化麦芽糖和蜜里三糖；
c)氢化麦芽糖和蜜里三糖，以及，海藻糖、乳糖或蔗糖中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的稳定处方，其特征在于，所述氢化麦芽糖的使用终浓度为3-10w/v％，优选为5-10w/v％，进一步优选为6-10w/v％。
3.根据权利要求1所述的稳定处方，其特征在于，所述蜜里三糖的使用终浓度为2-10w/v％，优选为6-10w/v％，进一步优选为7-10w/v％。
4.根据权利要求1所述的稳定处方，其特征在于，所述海藻糖的使用终浓度为3-12w/v％，优选为6-12w/v％，进一步优选为7-11w/v％。
5.根据权利要求1所述的稳定处方，其特征在于，所述乳糖的使用终浓度为0.3-3w/v％，优选为0.3-1w/v％，进一步优选为0.4-0.9w/v％。
6.根据权利要求1所述的稳定处方，其特征在于，所述蔗糖的使用终浓度为2-9w/v％，优选为6-9w/v％，进一步优选为7-8w/v％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的稳定处方，其特征在于，所述PCR预混液包括PCR扩增预混液或PCR酶预混液。
8.一种冻干PCR预混液的方法，其特征在于，在PCR预混液中加入权利要求1-7任一项所述的稳定处方，经冻干得到冻干的PCR预混液。
9.权利要求8所述的方法制备得到的冻干的PCR预混液。
10.一种包括权利要求9所述的冻干的PCR预混液的试剂盒。
权 利 要 求 书1/1页CN 112481365 A
冻干PCR预混液的试剂
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种冻干PCR预混液的试剂。
背景技术
[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术，用于扩增特定的基
因片段，目前该技术已在全世界范围内广泛应用，因其具有较高的灵敏度，优良的特异性，并且具有操作简便，快捷等优点，在生物和医学研究中起到了举足轻重的作用。
[0003]目前市场流通的用于基因检测的PCR试剂大部分为液体试剂，且扩增所需的各个组分通常需要分几管分装，常温储存并不稳定，需要进行超低温保存和运输，这就给储存和运输带来很大不便，同时试剂的效期短，在检测操作中增加了环境中气溶胶对扩增体系的污染风险。对此，将液体试剂混合冻干制备成冻干的PCR预混液进行保存为目前的一种改进方法。
[0004]市场上冻干的PCR预混液按照是否含有扩增引物分为两种，一种是冻干PCR扩增预混液，另外一种是冻干PCR酶预混液，其区别在于，前者为设计好的针对目的基因的全混检测试剂，直接加水复溶后，添加待检样本即可检测；而后者仅含有PCR扩增所需的酶，有的还含有扩增所需的底物，其可根据需求应用于各类目的基因的检测。目前冻干PCR预混液的冻干难点之一是稳定处方，稳定处方不仅需要保证冻干PCR预混液成型，保存期理想，更重要的是引入的处方不干扰、不破坏预混液各试剂的PCR扩增效率。
[0005]有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006]本发明的第一目的在于提供一种用于冻干PCR预混液的稳定处方，以保证冻干PCR 预混液成型，保存期理想，更重要的是引入的处方不干扰、不破坏预混液各试剂的PCR扩增效率。
[0007]本发明的第二目的在于提供一种冻干PCR预混液的方法。
[0008]本发明的第三目的在于提供冻干的PCR预混液，以缓解现有技术中冻干的PCR预混液相较于冻干前扩增效率差距大等问题。
[0009]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0010]一种用于冻干PCR预混液的稳定处方，所述稳定处方包括如下a)-c)任一种组成：[0011]a)氢化麦芽糖；
[0012]b)氢化麦芽糖和蜜里三糖；
[0013]c)氢化麦芽糖和蜜里三糖，以及，海藻糖、乳糖或蔗糖中的至少一种。
[0014]进一步地，所述氢化麦芽糖的使用终浓度为3-10w/v％，优选为5-10w/v％，进一步优选为6-10w/v％。
[0015]进一步地，所述蜜里三糖的使用终浓度为2-10w/v％，优选为6-10w/v％，进一步优
选为7-10w/v％。
[0016]进一步地，所述海藻糖的使用终浓度为3-12w/v％，优选为6-12w/v％，进一步优选为7-11w/v％。
[0017]进一步地，所述乳糖的使用终浓度为0.3-3w/v％，优选为0.3-1w/v％，进一步优选为0.4-0.9w/v％。
[0018]进一步地，所述蔗糖的使用终浓度为2-9w/v％，优选为6-9w/v％，进一步优选为7-8w/v％。
[0019]进一步地，所述PCR预混液包括PCR扩增预混液或PCR酶预混液。
[0020]一种冻干PCR预混液的方法，在PCR预混液中加入稳定处方，经冻干得到冻干的PCR 预混液。
[0021]上述方法制备得到的冻干的PCR预混液。
[0022]一种包括上述冻干的PCR预混液的试剂盒。
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024]本发明提供的用于冻干PCR预混液的稳定处方，由如下a)-c)任一种组成：a)氢化麦芽糖；b)氢化麦芽糖和蜜里三糖；c)氢化麦芽糖和蜜里三糖，以及，海藻糖、乳糖或蔗糖中的至少一种。氢化麦芽糖
是一种冻干赋形剂，氢化麦芽糖的官能团是羟基，在冻干过程中对活性蛋白具有保护作用，本发明通过实验首次发现氢化麦芽糖作为用于冻干PCR预混液的稳定处方不会影响PCR的扩增反应，同时可以良好的保证冻干成型，具有稳定扩增Ct值和荧光值的效果。蜜里三糖为低聚物，带有五个结晶水，在环境中不吸潮，从而避免轧盖之前产品与室外空气接触的空档吸潮，进而解决了因产品吸潮而导致的产品性能不稳定性问题。此外，氢化麦芽糖和蜜里三糖又具有协同作用，氢化麦芽糖为冻干赋形剂，蜜里三糖为低温保护剂，低温保护剂和赋形剂结合既能使冻干成型又能起到对活性蛋白的保护作用。另外，海藻糖、乳糖和蔗糖也都具有稳定和低温保护的作用，并且令人意外的是还能一定程度提高PCR扩增效率，从而可以提高冻干的PCR预混液的整体性能。
[0025]本发明提供的冻干PCR预混液的方法，该方法简单易操作，制备冻干PCR预混液成本低。
[0026]本申请提供的冻干的PCR预混液与冻干前的PCR预混液性能差异小，并且有效期大大延长，稳定性更好，扩增效率相当或更好，包含该冻干的PCR预混液的试剂盒的稳定性和有效期也将得到显著的改善。
具体实施方式
[0027]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制
造商建议的条件进行。
[0028]除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0029]一种用于冻干PCR预混液的稳定处方，包括如下a)-c)任一种组成：
[0030]a)氢化麦芽糖；
[0031]b)氢化麦芽糖和蜜里三糖；
[0032]c)氢化麦芽糖和蜜里三糖，以及，海藻糖、乳糖或蔗糖中的至少一种。
[0033]氢化麦芽糖是一种冻干赋形剂，氢化麦芽糖的官能团是羟基，在冻干过程中对活性蛋白具有保护作用，本发明通过实验首次发现氢化麦芽糖作为用于冻干PCR预混液的稳定处方不会影响PCR的扩增反应，同时可以良好的保证冻干成型，具有稳定扩增Ct值和荧光值的效果。
[0034]蜜里三糖为低聚物，带有五个结晶水，在环境中不吸潮，从而避免轧盖之前产品与室外空气接触的空档吸潮，进而解决了因产品吸潮而导致的产品性能不稳定性问题。[0035]此外，氢化麦芽糖和蜜里三糖又具有协同作用，氢化麦芽糖为冻干赋形剂，蜜里三糖为低温保护剂，低温保护剂和赋形剂结合既能使冻干成型又能起到对活性蛋白的保护作用。
[0036]另外，海藻糖、乳糖和蔗糖也都具有稳定和低温保护的作用，并且令人意外的是还能一定程度提高PCR扩增效率，从而可以提高冻干的PCR预混液的整体性能。需要说明的是，方案c)中稳定处方可以为氢化麦芽糖、蜜里三糖和海藻糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖和乳糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖和蔗糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖、海藻糖和乳糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖、海藻糖和蔗糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖、乳糖和蔗糖；氢化麦芽糖、蜜里三糖、海藻糖、乳糖和蔗糖。
[0037]可以理解的是，本发明提供的各物质使用终浓度是指在应用于PCR预混液冻干保存时，各物质的使用浓度，具体含义为：以待冻干PCR预混液体积为参照需要加入的各物质质量。
[0038]在优选地实施方式中，对于a)，稳定处方由氢化麦芽糖组成，氢化麦芽糖的使用终浓度为3-10w/v％，优选为5-10w/v％，进一步优选为6-10w/v％。氢化麦芽糖的使用终浓度典型但非限制性的为3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％、8w/v％、9w/v％或10w/v％。本发明对氢化麦芽糖的用量进行了限定，正是由于实验证明上述浓度对PCR预混液的冷冻稳定性效果较优，并且通过进一步地优化限定，效果更好。
[0039]在优选地实施方式中，对于b)，稳定处方由氢化麦芽糖和蜜里三糖组成，氢化麦芽糖的使用终浓度为3-10w/v％，优选为5-10w/v％，进一步优选为6-10w/v％；蜜里三糖的使用终浓度为2-10w/v％，优选为6-10w/v％，进一步优选为7-10w/v％。蜜里三糖的使用终浓度典型但非限制性的为2w/v％、3w/v％
、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％、8w/v％、9w/v％或10w/v％。本发明研究发现，在氢化麦芽糖的基础上加入蜜里三糖，蜜里三糖在PCR预混液冻干中可以起到低温保护的作用，同时防止冻干产品的吸潮现象，对稳定冻干的PCR预混液具有良好效果，进一步研究发现，蜜里三糖在本发明提供的浓度范围内效果较好，对浓度的逐步优化也提高了效果。
[0040]在优选地实施方式中，对于c)，稳定处方由氢化麦芽糖和蜜里三糖，以及，海藻糖、乳糖或蔗糖中的至少一种组成。氢化麦芽糖的使用终浓度为3-10w/v％，优选为5-10w/v％，进一步优选为6-10w/v％；蜜里三糖的使用终浓度为2-10w/v％，优选为6-10w/v％，进一步优选为7-10w/v％。当含有海藻糖时，海藻糖的使用终浓度为3-12w/v％，优选为6-12w/v％，进一步优选为7-11w/v％；当含有乳糖时，乳糖的使用终浓度为0.3-3w/v％，优选为0.3-1w/ v％，进一步优选为0.4-0.9w/v％；当含有蔗糖时，蔗糖的浓度为2-9w/v％，优选为6-9w/ v％，进一步优选为7-8w/v％。
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