(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510069489.2
(22)申请日 2015.02.10
G01N 1/28(2006.01)
G01N 1/34(2006.01)
G01N 21/76(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)G01N 33/553(2006.01)
(71)申请人深圳市新产业生物医学工程股份有
限公司
地址518122 广东省深圳市坪山新区金沙社
区金辉路16号
(72)发明人饶微 孙普 付金秋 李海容
刘望 李婷华 袁锦云
(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人生启
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种用于IGF-Ⅰ化学发光免
疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒
及检测方法，属于体外诊断检测技术领域。该酸
性处理剂主要由浓度为0.1-0.5mol/L 的有机酸
溶液和浓度为0.01-0.1mol/L 的无机酸溶液混合
而成，或为浓度为0.3-2mol/L 的有机酸溶液，该
酸性处理剂的pH 值为1.5-3.5。该酸性处理剂
与样本混合后可以很好的分离样本中的IGF-Ⅰ
与IGFBP，达到检测要求。从而能够准确、可靠的
检测低浓度范围的样本。采用上述酸性处理剂的
IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒及样本预处理
方法和检测方法，能够准确、可靠的检测低浓度范
围的样本。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书13页
(10)申请公布号CN 104697829 A (43)申请公布日2015.06.10
C N 104697829
A
1.一种酸性处理剂，其特征在于，主要由浓度为0.1-0.5mol/L的有机酸溶液和浓度为0.01-0.1mol/L的无机酸溶液混合而成，或为浓度为0.3-2mol/L的有机酸溶液，该酸性处理剂的pH值为1.5-3.5。
2.根据权利要求1所述的酸性处理剂，其特征在于，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为5-20:1；或所述有机酸和二元无机酸的摩尔比为2.5-10:1；或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为1.6-6.6:1。
3.根据权利要求1所述的酸性处理剂，其特征在于，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为7-13:1；或所述有机酸和二元无机酸的摩尔比为3.5-6.5:1；或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为2.3-
4.3:1。
4.根据权利要求1所述的酸性处理剂，其特征在于，所述有机酸为甲酸、乙酸、苯甲酸、乙二酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、水杨酸中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的酸性处理剂，其特征在于，所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、、氯酸、亚硫酸、亚硝酸中的至少一种。
6.一种待测样本的预处理方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的酸性处理剂，将样本与所述酸性处理剂按照0.2-2:1的体积比混合，得到待测溶液，该待测溶液的pH值为2.0-4.0。
7.根据权利要求6所述的预处理方法，其特征在于，将样本与所述酸性处理剂混合后，还将待测溶液在30-40℃下温育3-7分钟。
8.一种IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
1)酸性处理剂：权利要求1-5任一项所述的酸性处理剂；
2)磁性微球体系：包括直接连接或间接连接抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1的磁性微球； 3)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体2；
所述抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1和抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体2的抗体位点互不相同。
9.根据权利要求8所述的IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。
10.根据权利要求8所述的IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。
11.根据权利要求8所述的IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述2)磁性微球体系中，所述间接连接抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1的磁性微球由包被抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球，和标记异硫氰酸荧光素的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1组成；或所述间接连接抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1的磁性微球由包被链霉亲和素的磁性微球，和标记生物素的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体1组成。
12.根据权利要求8所述的IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述3)标记物体系中，所述间接连接标记示踪物的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体2由标记生物素的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体2，和标记链霉亲和素的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的抗胰岛素样生长因子Ⅰ抗体2由标记异硫氰酸荧光素的抗胰岛素
样生长因子Ⅰ抗体2，和标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物组成。
13.一种IGF-Ⅰ化学发光免疫检测方法，其特征在于，采用上述权利要求8-12任一项所述的检测试剂盒，包括以下步骤：
1)预处理：按照权利要求6-7任一项所述的预处理方法进行样本预处理；
2)反应：在上述待测溶液中加入pH值为8.0-10.0的中和缓冲液，将待测溶液pH值调至6.0-8.0；再将待测溶液或含标准浓度胰岛素样生长因子Ⅰ的校准品与磁性微球体系和标记物体系反应，形成发光免疫复合
物；
3)检测：外加磁场将上述发光免疫复合物沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到胰岛素样生长因子Ⅰ的含量。
14.权利要求8-12任一项所述的IGF-Ⅰ化学发光免疫检测试剂盒在化学发光分析仪上的应用。
用于IGF-Ⅰ化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理
方法、试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种用于IGF-Ⅰ(胰岛素样生长因子Ⅰ)化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法。
背景技术
[0002] 胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，分子量约为7.5KU，主要由肝细胞合成和分泌，对机体生长发育起着重要调节作用。人体内多个组
织和脏器都表达IGF-Ⅰ基因，局部组织IGF-Ⅰ以自分泌或旁分泌形式产生。它与胰岛素样生长因子-Ⅱ和胰岛素具有结构同源性。血液循环中的胰岛素样生长因子-Ⅰ与胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基相结合，主要以高分子三体聚合物的形式存在。
[0003] 在人体内，生长激素(GH)和营养物的摄入对胰岛素样生长因子-Ⅰ的合成起刺激作用。刚出生时血浆中几乎检测不到胰岛素样生长因子-Ⅰ，儿童期逐步增加，青春期达到峰值，直到40岁左右开始逐渐下降。女性在怀孕时血浆胰岛素样生长因子-Ⅰ水平也有所升高。在诊断生长紊乱时，胰岛素样生长因子-Ⅰ可作为生长激素分泌的标志物。血浆或血清胰岛素样生长因子-Ⅰ浓度正常，可以作为排除生长激素缺乏的有力证据。胰岛素样生长因子-Ⅰ水平偏低提示生长激素缺乏，需作其他检查来明确是否存在生长激素分泌异常。胰岛素样生长因子-Ⅰ测量也可用作营养状况的改变。因为酸性不稳定组分和结合蛋白的存在，使得样本胰岛素样生长因子-Ⅰ测量变得复杂。酸处理对于释放胰岛素样生长因子-Ⅰ是必需的，以保证准确定量。
[0004] 胰岛素样生长因子-Ⅰ在临床检测中已逐渐被广泛应用。目前市场上主要的检测方法有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)。
[0005] 其中，放射免疫分析法(RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。主要原理为加入定量的125I标记IGF-Ⅰ(*Ag)与样本中的未标记IGF-Ⅰ(即待测抗
原)竞争性结合定量的IGF-Ⅰ抗体(Ab)。如果实验结果所计量到的结合物(*Ag-Ab)放射活性越高，表示待测物的IGF-Ⅰ浓度越低。如果所计量到的结合物放射活性越低，则表示待测物的浓度越高。藉由标准曲线图的分析，可以推算出待测物的浓度。
[0006] 酶联免疫吸附试验法(ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。主要原理为让IGF-Ⅰ抗体与酶复合物结合，然后通过显来检测。主要方法为用纯化的人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝，并在酸的作用下转化成最终的黄。颜的深浅和样本中的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样本中人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)浓度。
[0007] 化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以游离形式用于催化剂(酶)和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。主要原理为采用针对IGF-Ⅰ的一株单克隆抗体标记上标记示踪物，另一株单克隆抗体包被微球。标本、校准品与发光物标记的抗IGF-Ⅰ单克隆抗体2，微球包被的抗I
GF-Ⅰ抗体1混匀，形成免疫复合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入标本测量室，仪器自动泵入化学发光激发物1和2，自动监测3秒钟内发出的相对光强度(RLU)。IGF-Ⅰ浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算IGF-Ⅰ浓度。
[0008] 以上方法中，目前临床上使用最多也最简单快捷的是化学发光免疫分析法。市场流通的主要生产厂家有西门子和Liasion。两厂家在方法学设置上基本一致，均为一株针对IGF-Ⅰ的单克隆抗体标记发光物，另一株针对IGF-Ⅰ的单克隆抗体包被固相载体。在检测时，需要将样本加入一定比例酸性处理剂进行自动预稀释处理后，方可上机检测(其中，西门子的检测试剂盒中自动预稀释比例为1:10，Liasion的检测试剂盒中自动预稀释比例为1:20)。
[0009] 但是，此种方法存在多种问题：首先，由于样本在检测前均要进行预稀释，结果计算时又将结果乘以稀释倍数得到最终的IGF-Ⅰ浓度，所以少数低值样本无法检测到其确切值，并且，稀释可能会对一些样本的检测准确性和重复性带来不良影响。其次，在上述试剂盒中样本预处理中并未进行温育，可能存在部分样本中IGF-I释放不充分的风险。
发明内容
[0010] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种酸性处理剂，采用该酸性处理剂，无需在检测时对样本进行预稀释，能够准确和可靠的检测低浓度范围的样本。[0011] 为实现上述目的，本
发明采取以下技术方案：
[0012] 一种酸性处理剂，主要由浓度为0.1-0.5mol/L的有机酸溶液和浓度为0.01-0.1mol/L的无机酸溶液混合而成，或为浓度为0.3-2mol/L的有机酸溶液，该酸性处理剂的pH值为1.5-3.5。
[0013] 本发明人通过大量研究实验考察后发现，常规技术中需要将样本进行稀释，是因为在样本中，游离的胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)很少，大部分IGF-Ⅰ是与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)紧密结合，必须通过酸性溶液处理才可使二者分离。为了将所有的IGF-Ⅰ释放出来，需要加入过量的酸剂处理，而由于受到加入盐酸的量所限制，只能将样本稀释，使加入的盐酸足以将所有IGF-Ⅰ释放，才能满足检测要求。
[0014] 并且，也不能简单通过提高盐酸含量来达到避免稀释样本的目的，一方面是由于当盐酸浓度过高时，其挥发性也相应较大，对仪器有较高要求，且可能会对检测准确性造成一定影响；另一方面来说，当盐酸浓度过高时，过强的酸性会对样本造成不良影响，从而降低了检测的准确性。
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