(10)申请公布号 CN 102220391 A
(43)申请公布日 2011.10.19C N 102220391 A
*CN102220391A*
(21)申请号 201010146315.9
(22)申请日 2010.04.14
C12P 19/04(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(71)申请人冠生园(集团)有限公司
地址200040 上海市新闸路1418号
申请人上海市工业微生物研究所
(72)发明人周晓燕 李爽 周荣智 徐燕娟
殷蓓蓓 李传玉 李沈轶
(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公
司 31100
代理人陈静
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种提取真菌多糖的方法。本发
明提供了一种从真菌菌丝体提取真菌多糖的理想
方法。本发明还提供了用于提取真菌多糖的较佳
的酶组合。与传统的多糖提取法比较，本发明的方
法有效地提高了多糖的提取率，获得的产物多糖
含量高。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 2 页
1.一种复合酶制剂，其特征在于，含有：
1-5重量份纤维素酶；
1-5重量份果胶酶；和
1-5重量份蛋白酶。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，
所述的纤维素酶是Econase HCP；
所述的果胶酶是Pectinase PL；或
所述的蛋白酶是Protease N。
3.权利要求1或2所述的复合酶制剂的用途，用于提取真菌多糖。
4.一种提取真菌多糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将权利要求1所述的复合酶加入到含有真菌菌丝体原料的水中，酶解真菌菌丝体原料，得到酶解产物；
(2)将(1)的酶解产物进行水提取和乙醇沉淀，收集沉淀产物，其富集了真菌多糖。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的复合酶中各酶在水中的终浓度按照质量百分数是0.1±0.05％。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的水提取包括：将酶解产物升温至100±20℃，热水提取3±1小时，冷却，离心，获取离心上清。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，获得离心上清后，还包括：调节离心上清的体积，使得相对于1g真菌菌丝体原料，所述离心上清的体积为1.5-6ml。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的乙醇沉淀包括：在离心上清中加入乙醇，混匀，4±3℃静置，离心获取沉淀产物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，乙醇的加入体积是离心上清的0.5-10倍。
10.一种提取真菌多糖的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：权利要求1或2所述的复合酶制剂。
提取真菌多糖的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种提取真菌多糖的方法。
背景技术
[0002] 真菌多糖是具有高度免疫活性的一类多糖，广泛地存在于真菌的子实体和菌丝体中，高纯度的真菌多糖既可以直接用于口服，也可以加工成注射制剂。真菌多糖可有效提高机体免疫力且毒副作用小。
[0003] 在真菌多糖的提取方面，目前国内外主要采用热水浸提法和溶剂提取法。热水浸提法是一种常规的提取方法，其优点是提取条件温和，操作简单、方便；但存在的缺点是多糖得率不高。本领域目前一般仍采用传统的热水浸提法。
[0004] 溶剂提取法主要采用低浓度的草酸、草酸铵、盐酸、氢氧化钠等溶剂提取。有资料表明，酸、碱在多糖提取率方面均高于常规热水提取。然而，酸对多糖有水解作用，且操作比较繁杂，故多不采用酸提法。而盐对多糖的提取率提高不大。碱法的多糖得率比水提取及酸提取高，但要注意碱浓度不能太高，以免多糖变性；而且碱法提取条件剧烈，容易引起多糖变性，对多糖也有降解作用，且提取液粘稠，不易过滤。
[0005] 鉴于水浸提法存在多糖提取率低的技术缺陷，本领域迫切需要改进真菌多糖的提取技术，以进一步提高真菌多糖的提取率。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于提取真菌多糖的复合酶制剂。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种提取真菌多糖的方法。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种复合酶制剂，含有：
[0009] 1-5重量份纤维素酶；
[0010] 1-5重量份果胶酶；和
[0011] 1-5重量份蛋白酶。
[0012] 在一个优选例中，所述复合酶制剂含有：
[0013] 1-3重量份；更佳地1-2重量份；更佳地1-1.2重量份；更佳地1重量份纤维素酶；[0014] 1-3重量份；更佳地1-2重量份；更佳地1-1.2重量份；更佳地1重量份果胶酶；和[0015] 1-3重量份；更佳地1-2重量份；更佳地1-1.2重量份；更佳地1重量份蛋白酶。[0016] 在一个优选例中，所述的纤维素酶是Econase HCP；所述的果胶酶是
Pectinase PL；或所述的蛋白酶是Protease N。
[0017] 在另一优选例中，所述的制剂还含有：有效量的工业、药学或食品学上可接受的载体。
[0018] 在另一优选例中，所述的载体是水。
[0019] 在另一优选例中，含有1-5000重量份的载体。
[0020] 在另一优选例中，纤维素酶Econase HCP、果胶酶Pectinase PL和蛋白酶
Protease N的比例是(1-5)∶(1-5)∶(1-5)；较佳地为(1-3)∶(1-3)∶(1-3)；更佳
地为(1-2)∶(1-2)∶(1-2)；更佳地为1∶1∶1。
[0021] 在本发明的另一方面，提供所述的复合酶制剂的用途，用于提取真菌多糖。[0022] 在本发明的另一方面，提供一种提取真菌多糖的方法，所述方法包括：
[0023] (1)将所述的复合酶加入到含有真菌菌丝体原料(真菌子实体或其它组织)的水中，酶解真菌菌丝体原料，得到酶解产物；
[0024] (2)将(1)的酶解产物进行水提取和乙醇沉淀，收集沉淀产物，其富集了真菌多糖。
[0025] 在一个优选例中，所述的真菌菌丝体原料为粉末状或粒状。
[0026] 在另一优选例中，所述的真菌是选自冬虫夏草、灵芝、猪苓、姬松茸等。
[0027] 在另一优选例中，步骤(1)中，所述的复合酶中各酶在水中的终浓度按照质量百分数是0.1±0.05％。
[0028] 较佳地，所述的复合酶在水中的终浓度是0.1±0.02％，如0.1±0.01％。[0029] 在另一优选例中，酶解的温度为55±3℃；更佳地为55±2℃。
[0030] 在另一优选例中，酶解的时间为3±1小时。
[0031] 在另一优选例中，步骤(2)中，所述的水提取包括：将酶解产物升温至100±20℃，热水提取3±1小时，冷却，离心，获取离心上清。
[0032] 在另一优选例中，冷却到4℃。较佳地，在4℃保存过夜后进行离心。
[0033] 在另一优选例中，离心取上清时，离心转速为5000±2000rpm/min；较佳的，离心转速为5000±1000rpm/min。
[0034] 在另一优选例中，离心取上清时，离心时间为25±10min；较佳的，离心时间为25±5min。
[0035] 在另一优选例中，获得离心上清后，还包括：调节离心上清的体积，使得相对于1g 真菌菌丝体原料，所述离心上清的体积为1.5-6ml。
[0036] 较佳地，调节离心上清的体积，使得相对于1g真菌菌丝体原料，所述离心上清的体积为1.5-5ml；更佳地为1.5ml。
[0037] 在另一优选例中，通过将离心上清浓缩来调节离心上清的体积。较佳地，进行真空浓缩。较佳地，浓缩时温度控制在60℃以下。
[0038] 在另一优选例中，所述的乙醇沉淀包括：在离心上清中加入乙醇，混匀，4±3℃静置，离心获取沉淀产物。
[0039] 在另一优选例中，乙醇的加入体积是离心上清的0.5-10倍。
[0040] 较佳地，乙醇的加入体积是离心上清的3-8倍；更佳地为6倍。
[0041] 在另一优选例中，离心上清与乙醇混匀后，4±3℃静置8-48小时；较佳地静置10-24小时。更佳地，4℃静置16-24小时。
[0042] 在另一优选例中，离心取沉淀时，离心转速为5000±2000rpm/min；较佳的，离心转速为5000±1000rpm/min。
[0043] 在另一优选例中，离心取沉淀时，离心时间为25±10min；较佳的，离心时间为25±5min。
[0044] 在另一优选例中，步骤(2)后，还包括：对富集了真菌多糖的产物进行进一步纯
化，从而得到纯度更高的真菌多糖。
[0045] 在本发明的另一方面，提供一种提取真菌多糖的试剂盒，所述的试剂盒含有：所述的复合酶制剂。
[0046] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还含有：乙醇。
[0047] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0048] 图1：不同浓缩程度对醇沉多糖得率影响的直观分析图。
[0049] 图2：不同乙醇倍数对醇沉多糖得率影响的直观分析图。
[0050] 图3：酶制剂筛选实验流程图。
[0051] 图4：复合酶提取实验流程图。
具体实施方式
[0052] 本发明人采用生物技术法(复合酶法)进行多糖提取工艺的研究，到了一种从真菌菌丝体提取真菌多糖的理想方法。本发明人还到了用于提取真菌多糖的较佳的酶组合。该酶组合能够高效地水解真
菌菌丝体中细胞壁及细胞中的果胶质、纤维素以及游离的蛋白质，降低它们与原料的结合力，有利于多糖的浸出。与传统的热水浸提法比较，本发明的方法有效地提高了多糖的提取率。
[0053] 复合酶制剂
[0054] 自然界中存在的酶的种类很多，不同蛋白质原料水解产生的活性肽由于氨基酸组成、结构有差异，其功能也有很大差异。因此，要到合适的酶的组合并非易事。本发明人经过长期研究和试验，终于到了理想的酶组合。本发明提供一种复合酶制剂，其含有：纤维素酶，果胶酶和蛋白酶。
[0055] 使用本发明的复合酶，真菌多糖提取率最高，可能是纤维素酶、果胶酶、蛋白酶作用于纤维素、果胶、蛋白质以及一些胶凝物质等，使真菌菌粉结构变得松散，同时蛋白酶对游离蛋白质和与糖结合的蛋白具有水解作用，降低它们与原料或多糖的结合力，有利于多糖的浸出，并同时除去蛋白质，减轻后续脱蛋白的负担，而且酶解法条件温和，基本不会破坏多糖结构。
[0056] 进一步地，针对真菌多糖的提取，本发明人还对比了不同的纤维素酶之间、不同的果胶酶之间、不同的蛋白酶之间的不同效果，结果发现：优选的纤维素酶是Econase HCP；
优选的果胶酶是Pectinase PL；优选的蛋白酶是Protease N。这三种酶的组合具有极
其优异的有益效果。较佳的，所述的Econase HCP纤维素酶获自德国AB酶制剂公司；所
述的Pectinase PL果胶酶获自日本天野酶制品株式会社；所述的Protease N蛋白酶获
自日本天野酶制品株式会社。
[0057] 作为本发明的优选方式，纤维素酶Econase HCP、果胶酶Pectinase PL和蛋白
酶Protease N的比例是(1-5)∶(1-5)∶(1-5)；较佳地为(1-3)∶(1-3)∶(1-3)；更
佳地为(1-2)∶(1-2)∶(1-2)；更佳地为1∶1∶1。
[0058] 本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。
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