高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药物成分的方法与流程

1.本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药物成分的方法。

背景技术：

2.结核病是病人感染结核分枝杆菌后引起的传染性疾病，抗结核病的药物主要被分为四类：一线抗结核药物、二线抗结核药物、新型抗结核药物以及复方制剂药物。涉及到的一线抗结核药物主要包括利福平(rifamoicin,rmp)、(isoniazid,inh)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,pza)和乙胺丁醇(ethambutol,emb)。
3.抗结核药物测试主要有液相谱法-紫外法，液相谱-蒸发光散射法，液相谱-串联质谱法等。由于上述四种一线抗结核药物中乙胺丁醇无紫外吸收，所以必须带有蒸发光散射检测器进行检测，造成四种组分的同时准确检出困难。
4.鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供能够同时检测四种抗结核药物组分的高效液相串联质谱方法，以解决乙胺丁醇无法用于紫外检测的技术问题。
6.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供抗结核药物成分分离方法，所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种；
8.所述分离方法包括，含有抗结核药物成分的待测样本经甲醇沉淀除杂后，使用f5谱柱或c18谱柱，采用甲醇和甲酸铵水溶液配制流动相进行高效液相谱实现抗结核药物成分的分离。
9.在可选的实施方式中，所述高效液相谱的流动相a为含有1/1000(v/v)甲酸的甲酸铵水溶液，所述甲酸铵的浓度为5～15mm；流动相b为甲醇。
10.在可选的实施方式中，所述高效液相谱的流动相条件为，0～2min流动相a的体积比为87％～95％，2.1～4.5min流动相a的体积比为10％，4.51～5min流动相a的体积比为95％。
11.在可选的实施方式中，所述高效液相谱的液相条件为流动相流速为0.3～0.6ml/min，柱温为30～45℃，进样器温度为5～20℃，洗针液为体积比为1：(0.5～2)：(0.5～2)的甲醇、乙腈和异丙醇的混合溶液，进样量为1～20μl。
12.在可选的实施方式中，所述所述高效液相谱的液相条件为流动相流速为0.5ml/min，柱温为40℃，进样器温度为10℃，洗针液为体积比为1：1：1的甲醇、乙腈和异丙醇的混合溶液，进样量为1μl。
13.在可选的实施方式中，吡嗪酰胺、、乙胺丁醇和利福平对应的内标分别为吡嗪酰胺-15
n,d3、-d4、乙胺丁醇-d4和利福平-d4。
14.在可选的实施方式中，所述待测样本包括人血清。
15.优选地，所述人血清中血红蛋白浓度小于0.04g/l。
16.第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述分离方法在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用，所述药物含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种。
17.第三方面，本发明提供抗结核药物成分浓度检测方法，所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种；
18.所述检测方法包括采用前述实施方式任一项所述分离方法将待测样本中含有的抗结核药物成分分离，而后经质谱检测得到各成分浓度。
19.在可选的实施方式中，所述质谱检测的离子源参数为：离子源为esi+，气帘气压强为30～40psi，碰撞气压强为medium，喷雾电压为5500v，温度为450～550℃，喷雾气gs1压强为40～55psi，喷雾气gs2压强为40～60psi。
20.优选地，离子源参数为：离子源为esi+，气帘气压强为40psi，碰撞气压强为7psi，喷雾电压为500v，温度为500℃，喷雾气gs1压强为55psi，喷雾气gs2压强为60psi。
21.本发明提供的高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物的方法，一次检测可同时得到吡嗪酰胺、、乙胺丁醇和利福平四种一线抗结核药物，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。检测得到的吡嗪酰胺线性范围15.000～105.000μg/ml，1.000～19.000μg/ml，乙胺丁醇1.000～14.500μg/ml，利福平0.400～13.000μg/ml，相关系数均r≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，中值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，高值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％；准确度的相对偏差(b)≤
±
15％，加标回收率为98％～113％。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为甲醇蛋白沉淀样本后离心后直接进样结果图；
24.图2为乙腈萃取，离心后直接进样结果图；
25.图3为甲醇/乙腈＝1/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果图；
26.图4为甲醇/乙腈＝2/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果图；
27.图5为甲醇/乙腈＝3/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果图；
28.图6为甲醇/乙腈＝4/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果图；
29.图7为甲醇萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果图；
30.图8为流动相a中不含甲酸铵的进样结果图。
31.图9为c18柱使用酸性流动相进样结果图。
具体实施方式
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
33.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
35.本发明公开了高效液相质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物。人血清中的抗结核药物经过有机溶剂的蛋白沉淀，离心并且稀释后进行上样测试，且所有前处理都可以在96孔板中进行，使用排进行移取，实现批量前处理。样品经前处理后，进入液相谱质谱联用仪进行检测，五分钟之内即可完成测试四种药物测试，方便，快速。由于人源样本难以获得，本发明采用bsa作为人血清的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控。
36.1、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，主要包括下列试剂：
37.表1 标准品和试剂
[0038][0039][0040]
2、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，包括下列设备：
[0041]
表2 仪器设备
[0042]
序号设备名称型号/规格1液相谱串联质谱仪ab sciex triple quad tm4500md
296孔板振荡器mb100-4a396孔板离心机湘仪h2050r410μl移液器0.5-10μl5200μl移液器20-200μl61000μl移液器100-1000μl7300μl 12孔移液器30-300μl896孔板2ml996孔板1ml10电子天平十万分之一
[0043]
3、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，标准品及质控品配制：
[0044]
3.1、抗结核药物储备液配制
[0045]
吡嗪酰胺储备液配制：使用十万分之一电子天平，准确称取吡嗪酰胺100mg，置于10ml容量瓶，用甲醇溶解后并定容至刻度线，配制成10.00mg/ml浓度的储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0046]
储备液配制：使用十万分之一电子天平，准确称取100mg，置于10ml容量瓶，用甲醇溶解后并定容至刻度线，配制成10.00mg/ml浓度的储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0047]
乙胺丁醇储备液配制：使用十万分之一电子天平，准确称取乙胺丁醇100mg，置于10ml容量瓶，用甲醇溶解后并定容至刻度线，配制成10.00mg/ml浓度的储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0048]
利福平储备液配制：使用十万分之一电子天平，准确称取吡嗪酰胺100mg，置于10ml容量瓶，用甲醇溶解后并定容至刻度线，配制成10.00mg/ml浓度的储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0049]
3.2抗结核药物次级储备液配制
[0050]
吡嗪酰胺次级储备液配制：使用移液，准确移取1ml吡嗪酰胺储备液，转移至10毫升容量瓶，用甲醇定容至刻度线，配制成1.00mg/ml次级储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0051]
次级储备液配制：使用移液，准确移取100μl储备液，转移至10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度线，配制成0.10mg/ml次级储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0052]
乙胺丁醇次级储备液配制：使用移液，准确移取100μl乙胺丁醇储备液，转移至10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度线，配制成0.10mg/ml次级储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0053]
利福平次级储备液配制：使用移液，准确移取100μl利福平储备液，转移至10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度线，配制成0.10mg/ml次级储备液，转移至15mlhdpe塑料瓶中，贴标签，-80℃保存。
[0054]
3.3、校准品s1至s6配制
[0055]
3.3.1、稀释液配制
[0056]
pbs稀释液配制：量取10ml 10*pbs于100ml的容量瓶中，再加入纯水至刻度线，混合均匀，得到1*pbs，转移至玻璃容器瓶待用。
[0057]
0.1％bsa溶液配制：称取0.1g bsa，精确至0.0001g放入玻璃容器瓶中，加入100mlpbs稀释液，盖上瓶盖，上下震荡至bsa完全溶解。
[0058]
标准品配制根据高低配制模式进行，即配制好s1与s6后，通过比例混合配制成s2至s5及lqc，mqc和hqc。
[0059]
校准品s6配制：选用合适规格的移液分别取吡嗪酰胺储备液2.625ml，储备液0.475ml，乙胺丁醇储备液0.3625ml，利福平储备液0.325ml，置于合适的hdpe管内，加入0.1％bsa溶液21.2125ml，配制成吡嗪酰胺105.000μg/ml，19.000μg/ml，乙胺丁醇14.500μg/ml，利福平13.000μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0060]
校准品s1配制：选用合适规格的移液分别取吡嗪酰胺次级储备液0.75ml，次级储备液0.5ml，乙胺丁醇次级储备液0.5ml，利福平次级储备液0.2ml，置于合适的hdpe管内，加入0.1％bsa溶液48.05ml，配制成吡嗪酰胺15.000μg/ml，1.000μg/ml，乙胺丁醇1.000μg/ml，利福平10.400μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0061]
校准品s2配制：准确移取s1标准品19ml，s6标准品3.5ml，充分混合都，配制成吡嗪酰胺29.000μg/ml，3.800μg/ml，乙胺丁醇3.100μg/ml，利福平2.360μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0062]
校准品s3配制：准确移取s1标准品16ml，s6标准品63.5ml，充分混合都，配制成吡嗪酰胺41.000μg/ml，6.200μg/ml，乙胺丁醇4.900μg/ml，利福平4.040μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0063]
校准品s4配制：准确移取s1标准品12ml，s6标准品10.5ml，充分混合都，配制成吡嗪酰胺57.000μg/ml，9.400μg/ml，乙胺丁醇7.300μg/ml，利福平6.280μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0064]
校准品s5配制：准确移取s1标准品7ml，s6标准品15.5ml，充分混合都，配制成吡嗪酰胺77.000μg/ml，13.400μg/ml，乙胺丁醇10.300μg/ml，利福平9.080μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0065]
3.4、质控品配制
[0066]
低浓度质控品lqc配制：准确移取s1标准品21.2ml，s6标准品1.3ml，充分混合，配制成吡嗪酰胺20.200μg/ml，2.040μg/ml，乙胺丁醇1.780μg/ml，利福平1.128μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0067]
中浓度质控品mqc配制：准确移取s1标准品12ml，s6标准品10.5ml，充分混合，配制成吡嗪酰胺57.000μg/ml，9.400μg/ml，乙胺丁醇7.300μg/ml，利福平6.280μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0068]
高浓度质控品hqc配制：准确移取s1标准品6ml，s6标准品16.5ml，充分混合，配制成吡嗪酰胺81.000μg/ml，14.200μg/ml，乙胺丁醇10.900μg/ml，利福平9.640μg/ml标准溶液。充分混合后，贴标签，-20℃保存。
[0069]
4、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，样本萃取液配制。
[0070]
样本萃取液储备液配制：用十万分之一天平分别精确称取10mg吡嗪酰胺-15
n,d3，
10mg-d4，10mg乙胺丁醇-d4，10mg利福平-d4，精确至0.01mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度线，配制成1.00mg/ml储备液，贴标签，-20℃保存。
[0071]
样本萃取液配制：用合适规格的移液分别移取1000μl吡嗪酰胺-15
n,d3，100μl-d4，10μl乙胺丁醇-d4，500μl利福平-d4，置于500ml容量瓶中，加甲醇至刻度线，充分混匀配制成浓度为2.00μg/ml的吡嗪酰胺-15
n,d3，0.20μg/ml-d4，0.02μg/ml乙胺丁醇-d4，1.00μg/ml利福平-d4的样本萃取液。贴标签，-20℃保存。
[0072]
5、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，流动相配制：
[0073]
5m甲酸铵溶液配制：用电子天平准确称取15.765g甲酸铵，加入50毫升纯水，配制成5mol/l甲酸铵溶液50ml，置于4℃冰箱，待用。
[0074]
流动相a液配制：用量筒准确移取1000ml水，加入1000μl甲酸溶液及1000μl5m甲酸铵溶液，混匀后过滤并超声脱气，待用。
[0075]
流动性b液配制：甲醇溶液，过滤后超声脱气，待用。
[0076]
6、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，包括下列前处理过程：
[0077]
1)加校准品、质控品溶液：精密移取100μl校准品、质控品溶液，分别加入到2ml96孔板中；
[0078]
2)加血清样本：精密移取100μl的血清样本，分别加入到分别加入到2ml 96孔板中；
[0079]
3)加样本提取液：精密移取400μl样本萃取液，分别加入到以上对应的96孔板中；
[0080]
4)震荡：盖上96孔板盖，置于96孔板振荡器上，1500rpm充分震荡15min；
[0081]
5)离心：于冷冻离心机中，设置温度4℃，转速4000rpm离心10min；
[0082]
6)转移并稀释：离心后用移液移取100μl的上清液置于1ml96孔u型板中，分别加入300μl水；
[0083]
7)震荡：盖上96孔板盖，置于96孔板振荡器上，1500rpm充分震荡5min。
[0084]
8)离心：于冷冻离心机中，设置温度4℃，转速4000rpm离心10min，离心后样本待测。
[0085]
7、本发明公开了一款高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，包括下列方法设置：
[0086]
液相测试条件表
[0087]
1)谱柱：kinetex 2.6μm f5(3.0*100mm)
[0088]
2)流动相：a相：水(含0.1％甲酸+5mm甲酸铵)；b相：甲醇
[0089]
3)洗脱梯度：
[0090]
表3 梯度条件
[0091]
t(min)％a％b0.009552.0087132.1010904.501090
4.519555.00955
[0092]
4)流速：0.5ml/min
[0093]
5)柱温：40℃
[0094]
6)自动进样器温度：10℃
[0095]
7)洗针液：甲醇：乙腈：异丙醇(1：1：1，v/v/v)
[0096]
8)进样量：1μl
[0097]
质谱测试条件如下：
[0098]
离子源参数表
[0099]
表4 离子源参数
[0100][0101]
离子信息
[0102]
表5 离子信息
[0103][0104]
本方法采用高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物，一次检测可同时得到吡嗪酰胺，，乙胺丁醇，利福平四种一线抗结核药物，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。该方法吡嗪酰胺线性范围15.000～105.000μg/ml，1.000～19.000μg/ml，乙胺丁醇1.000～14.500μg/ml，利福平0.400～13.000μg/ml，相关系数均r≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，中值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，高值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％；准确度的相对偏差(b)≤
±
15％，加标回收率为98％～113％。
[0105]
实验数据
[0106]
1、前处理方法选择
[0107]
1.1、沉淀剂的选择
[0108]
分别使用甲醇，乙腈以及乙腈和甲醇混合溶液对样本进行蛋白沉淀处理，蛋白沉淀后的样本经离心后直接上样进行检测，结果如图1所示，显示在吡嗪酰胺峰有分叉现象，针对此现象推断是由于谱溶剂效应引起，故对离心后样本萃取液进行进一步用水稀释处理，使其溶液中的比例尽可能接近流动相初始比例。乙腈萃取，离心后直接进样结果如图2所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。甲醇/乙腈＝1/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果如图3所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。甲醇/乙腈＝2/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样结果如图4所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。甲醇/乙腈＝3/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样如图5所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。甲醇/乙腈＝4/1萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样如图6所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。甲醇萃取，用水稀释4倍后离心后直接进样如图7所示，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。图8为流动相a中不含甲酸铵的进样结果图，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。图9为c18柱使用酸性甲酸铵作为流动相进样结果图，图中峰的顺序由左到右分别为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。
[0109]
通过对甲醇，乙腈以及甲醇乙腈的混合溶液进行蛋白沉淀剂，稀释测得的峰型结果判断，用甲醇和甲醇乙腈混合溶液作为沉淀剂的结果都可以满足要求，由于乙腈的毒性及价格都高于甲醇，为此后面试验选择用甲醇作为沉淀剂进行试验。
[0110]
2、谱条件选择
[0111]
2.1、谱柱选择
[0112]
分别选用kinetex f5(100mm*3mm，2.6μm)谱柱及xbridgebeh c18(50mm*3mm，2.5μm)。使用甲醇和甲酸铵水溶液作为流动相，通过调节加入氨水或者甲酸调节峰型，结果显示使用两种谱柱都能将四种化合物分开，本发明选用f5柱作为最终测试条件谱柱。
[0113]
在c18条件下，使用a相为甲醇，b相为10mm甲酸铵水溶液，通过加入氨水使其ph为8，梯度条件如下表所示，出峰顺序由左到右依次为、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和利福平。
[0114]
表6 梯度程序
[0115][0116][0117]
在f5条件下，使用a相为甲醇，b相为15mm甲酸铵水溶液，通过加入千分之一甲酸调节ph，改善峰型，梯度条件如下表所示，出峰顺序由左到右依次为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。
[0118]
表7 梯度程序
[0119]
t(min)％a％b流速0.009550.5ml/min2.0087130.5ml/min2.1010900.5ml/min4.5010900.5ml/min4.519550.5ml/min5.009550.5ml/min
[0120]
2.2、流动相选择
[0121]
2.2.1流动相选择
[0122]
使用f5柱，通过调节ph及不同浓度的甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，对化合物进行分析检测，最终选择5mm的甲酸铵含有千分之一甲酸水溶液与甲醇作为最终测试条件流动相。
[0123]
使用f5柱，a相为15mm甲酸铵水溶液含甲酸0.2％水，b相为甲醇，梯度流程为下表所示，出峰顺序由左到右依次为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。
[0124]
表8 梯度程序
[0125]
t(min)％a％b流速0.009550.5ml/min2.0087130.5ml/min2.1010900.5ml/min4.5010900.5ml/min4.519550.5ml/min5.009550.5ml/min
[0126]
使用f5柱，a相为10mm甲酸铵水溶液含甲酸0.1％水，b相为甲醇，梯度流程为下表所示，出峰顺序由左到右依次为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。
[0127]
表9 梯度程序
[0128][0129][0130]
使用f5柱，a相为5mm甲酸铵水溶液含甲酸0.1％水，b相为甲醇，梯度流程为下表所示，出峰顺序由左到右依次为乙胺丁醇、、吡嗪酰胺和利福平。
[0131]
表10 梯度程序
[0132]
t(min)％a％b流速0.009550.5ml/min
2.0087130.5ml/min2.1010900.5ml/min4.5010900.5ml/min4.519550.5ml/min5.009550.5ml/min
[0133]
2.2.2流动相中加入甲酸铵与不加甲酸铵比较
[0134]
使用f5柱，通过比较流动相a相中加入甲酸铵对测试结果的影响，最终选择5mm的甲酸铵含有千分之一甲酸水溶液与甲醇作为最终测试条件流动相。
[0135]
按校准品及质控品前处理操作方法对校准品及质控品进行前处理，处理后液体分别用两种流动相进行样本分析。
[0136]
流动相方法一：a相为0.2％甲酸水溶液，b相为甲醇，梯度条件表11，结果如表13所示，结果图如图8所示。
[0137]
表11 方法一梯度条件
[0138]
t(min)％a％b流速0.009550.5ml/min2.0087130.5ml/min2.1010900.5ml/min4.5010900.5ml/min4.519550.5ml/min5.009550.5ml/min
[0139]
流动相方法二：a相为0.1％甲酸，5mm甲酸铵水溶液，b相为甲醇，梯度条件表12，结果如表13所示，结果图如图7所示。
[0140]
表12 方法二梯度条件
[0141][0142][0143]
表13 方法一与方法二结果比较
[0144][0145]
比较图8与图7，不加甲酸铵对第一个乙胺丁醇峰型影响较大，出现叉峰。从表13结果对方法一与方法二进行比较，结果显示甲酸铵的加入对乙胺丁醇线性有明显改善，相关线性系数有明显提高，为此最终选用甲酸铵与甲酸水溶液作为流动相a。
[0146]
2.2.3、内标选择
[0147]
通过检测利福平准确度样品，计算其回收率来评价准确度，评估准确度是否符合性能评价的要求。在空白人源基质中加入一定量的待测物工作溶液，制成4个浓度的待回收样本定量下限浓度，低浓度质控、中浓度质控，高浓度质控，每个浓度重复测定3个样本。
[0148]
按校准品及质控品前处理操作方法对校准品及质控品进行前处理，处理后液体进行样本分析，分析结果分别采用利福平d4和吡嗪酰胺-15
n,d3作为内标对利福平进行定量检测分析，分析结果如表14所示。
[0149]
表14 不同内标对利福平测试结果影响
[0150]
[0151][0152]
从表14结果可看出，使用利福平d4作为内标，人源样本基质加标回收率为93.55％～106.42％之间，使用吡嗪酰胺-15
n,d3作为内标，结果显示利福平的加标回收率为32.41％至68.87％，为此在本方案中最终选用利福平-d4作为内标，测试利福平。
[0153]
3、线性范围试验数据
[0154]
3.1、验证方法：按照高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物描述的样品处理方法处理待测产品校准品s1～s6溶液，每个浓度重复测试3次。可参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数r^2应≥0.990。
[0155][0156]
r：线性回归相关系数
[0157]
xi：s1～s6的浓度
[0158]
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值
[0159]
3.2、接受标准：乙胺丁醇，，吡嗪酰胺，利福平线性回归的相关系数r均≥0.990。
[0160]
3.3、实验结果
[0161]
线性范围：吡嗪酰胺线性范围15.000～105.00μg/ml，线性范围1.000～19.000μg/ml，乙胺丁醇线性范围1.000～10.300μg/ml，利福平线性范围0.400～13.000μg/
ml。
[0162]
表15 线性为数据
[0163][0164]
3.4、结论：乙胺丁醇，，吡嗪酰胺，利福平线性回归的相关系数r^2均≥0.990，满足接受标准。
[0165]
4、重复性测试数据
[0166]
4.1、验证方法：使用已配制好的质控品，按照高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物描述的样品处理方法处理待测产品，每个样本重复测定10次。可参考公式计算重复性的变异系数(cv)，低值质控品cv≤20％，高值质控品cv≤15％。
[0167][0168]
cv：重复性的变异系数
[0169]
10次测量结果的平均值
[0170]
s：10次测量结果的标准差
[0171]
4.2、接受标准：低值质控品的变异系数cv≤20％，中值质控品的变异系数cv≤
15％，高值质控品的变异系数cv≤15％。
[0172]
4.3、实验结果
[0173]
表16 吡嗪酰胺重复性数据
[0174][0175]
表17 重复性数据
[0176][0177][0178]
表18 乙胺丁醇重复性数据
[0179][0180]
表19 利福平重复性数据
[0181][0182][0183]
4.4、结论：低值质控品的变异系数cv≤15％，高值质控品的变异系数cv≤15％，满足接受标准。
[0184]
5、基质效应评价
[0185]
5.1、实验流程
[0186]
使用至少6批来自不同供体的空白基质，对于每批基质，应该通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得)，与不含基质的相应峰而积(分析物和内标的纯溶液)比值，计算每一分析物和内标的基质因子，进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。
[0187]
5.2、接受标准
[0188]
从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数均应小于15％。
[0189]
5.3、实验结果
[0190]
表20 吡嗪酰胺基质效应数据
[0191][0192]
表21基质效应数据
[0193][0194]
表22 乙胺丁醇基质效应数据
[0195][0196]
表23 利福平基质效应数据
[0197][0198]
5.4、实验小结
[0199]
批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数均小于15％，满足要求。
[0200]
6、血样干扰评价
[0201]
6.1、实验流程
[0202]
通过干扰实验程序筛选潜在干扰物质，量化干扰效应，证实病人样本中的干扰，确认分析方法对干扰物质的敏感性，评估潜在的风险，并将有意义的干扰声明提供给客户。
[0203]
按照实验设计的干扰物浓度要求，在基础样本上添加一定量的干扰物贮存液作为
测试样本，本实验方案添加量统一为基础标本的5％添加量。在基础样本中统一添加5％制备贮存液的溶剂作为对照样本，其添加体积与测试样本相同。按交互顺序分析测试标本和对照标本。
[0204]
6.2、接受标准
[0205]
若dev％＝(xtest-xcontrol)/xcontrol≤15％，则潜在干扰物质对分析物的测定没有影响，否则可以判断潜在的干扰成立。
[0206]
6.3、实验结果
[0207]
表24 干扰物名称及其浓度
[0208][0209][0210]
表25 胆红素干扰实验结果
[0211][0212]
表26 甘油三酯干扰实验结果
[0213][0214][0215]
表27 胆固醇干扰实验结果
[0216][0217]
表28 血红蛋白干扰实验结果
[0218][0219][0220]
表29 利福平血红蛋白干扰实验结果
[0221]
[0222]
6.4、实验小结
[0223]
本实验干扰物浓度主要参照《ws/t-2013干扰实验指南》中常见内源性干扰物的建议实验浓度，由于在此建议浓度下，血红蛋白对利福平检测影响较大，故将血红蛋白浓度降低，以得到对利福平检测无影响的血红蛋白浓度。经试验得到当血清中血红蛋白浓度为0.04g/l时，在本方法中对利福平检测无影响。
[0224]
7.准确度
[0225]
7.1试验过程
[0226]
本方案通过检测吡嗪酰胺、、乙胺丁醇和利福平准确度样品，计算其回收率来评价准确度。评估准确度是否符合性能评价的要求。在空白人源基质中加入一定量的待测物工作溶液，制成2个浓度的待回收样本l、h(即质控样品)。浓度选择包括低浓度水平、高浓度水平，取三个分析批，每个浓度重复测定3个样本。
[0227]
7.2接受标准
[0228]
回收率：85％～115％。
[0229]
表30 吡嗪酰胺准确度
[0230][0231]
表31 准确度
[0232][0233]
表32 乙胺丁醇准确度
[0234][0235][0236]
表33 利福平准确度
[0237][0238]
7.3实验小结
[0239]
满足准确度在标示值的
±
15％以内，满足要求。
[0240]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：

1.抗结核药物成分分离方法，其特征在于，所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种；所述分离方法包括，含有抗结核药物成分的待测样本经甲醇沉淀除杂后，使用f5谱柱或c18谱柱，采用甲醇和甲酸铵水溶液配制流动相进行高效液相谱实现抗结核药物成分的分离。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相谱的流动相a为含有1/1000(v/v)甲酸的甲酸铵水溶液，所述甲酸铵的浓度为5～15mm；流动相b为甲醇。3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相谱的流动相条件为，0～2min流动相a的体积比为87％～95％，2.1～4.5min流动相a的体积比为10％，4.51～5min流动相a的体积比为95％。4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相谱的检测条件为流动相流速为0.3～0.6ml/min，柱温为30～45℃，进样器温度为5～20℃，洗针液为体积比为1：(0.5～2)：(0.5～2)的甲醇、乙腈和异丙醇的混合溶液，进样量为1～20μl。5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相谱的检测条件为流动相流速为0.5ml/min，柱温为40℃，进样器温度为10℃，洗针液为体积比为1：1：1的甲醇、乙腈和异丙醇的混合溶液，进样量为1μl。6.根据权利要求1～5任一项所述的分离方法，其特征在于，吡嗪酰胺、、乙胺丁醇和利福平对应的内标分别为吡嗪酰胺-15
n,d3、-d4、乙胺丁醇-d4和利福平-d4。7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述待测样本包括人血清；优选地，所述人血清中血红蛋白浓度小于0.04g/l。8.权利要求1～7任一项所述分离方法在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用，所述药物含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种。9.抗结核药物成分浓度检测方法，其特征在于，所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、、乙胺丁醇或利福平中至少一种；所述检测方法包括采用权利要求1～7任一项所述分离方法将待测样本中含有的抗结核药物成分分离，而后经质谱检测得到各成分浓度。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的离子源参数为：离子源为esi+，气帘气压强为30～40psi，碰撞气压强为medium，喷雾电压为5500v，温度为450～550℃，喷雾气gs1压强为40～55psi，喷雾气gs2压强为40～60psi；优选地，离子源参数为：离子源为esi+，气帘气压强为40psi，碰撞气压强为7psi，喷雾电压为500v，温度为500℃，喷雾气gs1压强为55psi，喷雾气gs2压强为60psi。

技术总结

本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及高效液相谱串联质谱同时检测多种抗结核药物成分的方法。本发明提供的高效液相谱串联质谱法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物的方法，一次检测可同时得到吡嗪酰胺、、乙胺丁醇和利福平四种一线抗结核药物，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。检测得到的低值质控品重复性的变异系数(CV)≤10％，中值质控品重复性的变异系数(CV)≤10％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤10％；准确度的相对偏差(B)≤