(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011102634.X
(22)申请日 2020.10.15
(83)生物保藏信息
CCTCC No. M 2020522 2020.09.18
(71)申请人 西藏自治区农牧科学院农业质量标
准与检测研究所
地址 850032 西藏自治区拉萨市金珠西路
149号
申请人 中国农业科学院油料作物研究所
(72)发明人 魏娜 张奇 岳晓凤 任显凤
王军 张飞龙 达娃卓玛
(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 苏士莹
(51)Int.Cl.
C12N 1/14(2006.01)
A23L 5/20(2016.01)C12R 1/885(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种桔绿木霉菌株XZ0509及
株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。本发
明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素
B1中的应用，将所述菌株XZ0509培养3天后，对
50ppt浓度的AFB1溶液降解率大于80％，培养7天
后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对10ppm
的AFB1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的
抑菌和抑产毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为
85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为
92.8％。表明所述菌株XZ0509可以应用到降解严
重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图1页CN 112159764 A 2021.01.01
C N 112159764
A
1.一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，其特征在于，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
2.根据权利要求1所述菌株XZ0509，其特征在于，所述菌株XZ0509的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，取XZ0509菌落边缘6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。
5.一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
权 利 要 求 书1/1页CN 112159764 A
一种桔绿木霉菌株XZ0509及其应用
技术领域
[0001]本发明属于黄曲霉毒素降解技术领域，具体涉及一种桔绿木霉菌株 XZ0509及其应用。
背景技术
[0002]黄曲霉毒素是主要由黄曲霉、寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强。
[0003]目前，在对黄曲霉菌的防治中，化学防治占据重要的地位。但其成本高，易污染环境，且在防控病原菌的同时病原菌也易对化学药剂产生耐药性甚至抗药性。如氨化法不适宜食物去除，NaOH法和混合溶剂萃取法虽然可用于部分固态食品种，但是要求特殊仪器，花费巨大，无推广应用价值，然而花费较少的高温法则会破坏食品中的基他营养成分，故不作为解毒的主要手段。因此，加强黄曲霉菌生物防控，逐渐成为人们关注的焦点和热点。木霉属(Trichoderma)真菌广泛存在于土壤及其它基物中，生存能力强，适应性广，是一种广谱性拮抗菌。近年来，已有不少文章陆续报道了该菌的某些种(拟康氏木霉、
康氏木霉、里氏木霉、绿木霉、哈茨木霉)对黄曲霉毒素有不同程度的降解作用，且同一种木霉不同菌株对黄曲霉毒素能力也不相同，还有部分木霉不具备降解黄曲霉毒素能力，但有关桔绿木霉对黄曲霉毒素的降解应用暂无报道。
发明内容
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桔绿木霉(Trichoderma. citrinoviride)菌株XZ0509及其应用，所述菌株XZ0509对黄曲霉毒素B1 具有极强的降解和耐受能力，可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
[0007]优选的，所述菌株XZ0509的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本发明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
[0009]优选的，该菌具有较强的解毒能力，取XZ0509菌落边缘6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄
曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养三天后对10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。
[0010]本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株 XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
[0011]本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，属半知
菌门，丝孢目，木霉属。PDA培养基生长初期菌丝体为黄，后期变为绿菌丝体，背面为黄绿，孢子丰富。产孢区在平板边缘呈现轮纹状, 形成一些疏松并且不规则的丛束分生孢子为淡绿、近似椭圆形。常用作生防菌，桔绿木霉可以产生纤维素酶、葡萄糖苷酶和木聚糖酶等多种酶，且桔绿木酶产内切-1，4-β-木聚糖酶。利用本发明所述菌株XZ0509，取菌落边缘 6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对高浓度10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的抑菌和抑毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％，依据 NY/T 3293-2018《黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程》，属中等抑菌活性、高等抑产毒活性生防菌株。这表明该木霉菌降解AFB1的能力及抑菌抑产毒能力都很强，可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
附图说明
[0012]图1为桔绿木霉XZ0509(XZ-5-9)对浓度为100ppb，1ppm，5ppm和 10ppm的AFB1的降解效率；条形柱上不同的字母表示极显著差异，根据单因素方差分析的Turkey±Kramer多重比较，p<0.001时差异极显著。
[0013]生物保藏信息
[0014]桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，于2020年9月18 保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020522。
具体实施方式
[0015]本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
[0016]本发明所述菌株XZ0509属半知菌门，丝孢目，木霉属。PDA培养基生长初期菌丝体为黄，后期变为绿菌丝体，背面为黄绿，孢子丰富。产孢区在平板边缘呈现轮纹状，形成一些疏松并且不规则的丛束分生孢子为淡绿、近似椭圆形。常用作生防菌，桔绿木霉可以产生纤维素酶、葡萄糖苷酶和木聚糖酶等多种酶，且桔绿木酶产内切1,4-β-木聚糖酶。在本发明中，所述菌株XZ0509优选分离筛选自西藏林芝市察隅县土壤中，且由深圳华大基因股份有限公司(en.g enomics/)，根据内转录间隔区
ITS(Interna l transcribed spacer)序列进行菌种鉴定。本发明所述菌株XZ0509的ITS序列如SEQ ID NO.1所示： TACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGT GGCCGCGCCGCGCTCC CGGTGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAG AGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGCCCGGTG AGG GGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAAT GACGCTCGGACAGGCATGCCCGCC AGAATACTGGCGGGCGCAATGTGC GTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGC CCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGG CTCAGAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGTAGGCCGCGACGGAGA GAAAA AAGAGTTTGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGG GGCTGCGACGCGCCCGGGGCAGAGAATCCCGCC GAGGCAACAGATTG GTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTC CGCAGGTTCACCTACGGAA。本发明对所述菌株XZ0509的分离方法并没有特殊限定，优选的在后期进行形态学鉴定时参考《真菌鉴定手册》，分子生物学鉴定采用TIANGEN公司真菌基因组
抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因的扩增。本发明所述目的基因的PCR扩增优选采用通用引物
ITS1(SEQ ID NO.2，5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(SEQ ID NO.3，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)；扩增程序优选包括95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。本发明优选对所述PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶检测，并将扩增产物送交上海桑尼生物科技有限公司测序，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析。
[0017]本发明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1(AFB1)中的应用。[0018]在本发明中，培养3天后，取菌落边缘6mm菌饼，对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对高浓度10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的抑菌和抑产毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％。
[0019]本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株 XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。本发明对所述生物菌剂的剂型并没有特殊限定，优选保证工作时所述菌株XZ0509生长5天时取边缘处直径 6mm菌饼即可。
[0020]下面结合实施例对本发明提供的桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride) 菌株XZ0509及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0021]实施例1
[0022]菌株是“西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所”从西藏林芝市察隅县土壤中分离获得的菌株，且由深圳华大基因股份有限公司 (h t t p s:// en.genomics/)，根据内转录间隔区ITS(Internal transcribed spacer) 序列进行菌种鉴定。各菌株详细信息如表1所示。
[0023]菌株形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》。分子生物学鉴定采用TIANGEN 公司真菌基因组抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因ITS的扩增。真菌PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4。扩增体系常规25μl，扩增程序如下： 95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。取 2μLPCR产物，1％琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物送交上海桑尼生物科技有限公司测序，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析。
[0024]表1实验用木霉菌株
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