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一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物、制备方法及用途

1.本发明涉及化学技术领域，具体来说涉及一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，该化合物的制备方法以及对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌、托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌具有抑制作用的用途。

背景技术：

2.在植物侵染性病害中,常见的主要有真菌性病害,细菌性病害,病毒性病害这三类。真菌病害是作物损失的主要原因之一，作物病害的80％由病原真菌所引起，真菌病的危害性极大，常见的有轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌，目前常用的农业抗菌剂有：噻唑锌，羟美唑，多菌灵等，但这类抗菌剂给环境保护带来了巨大的压力。植物病毒病是一种全球性病害，目前全世界发现的植物病毒种类已超过950种，是农业生产中仅次于真菌的第二大类世界性植物病害。烟草花叶病毒 (tobacco mosaic virus,tmv)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaicvirus,cmv)等病毒是典型的影响作物健康的植物病毒病，它们可侵入宿主细胞，从而造成植物叶片退绿直至整个植株坏死，对农作物造成了巨大的经济损失，目前，宁南霉素、病毒唑等是常用的抗植物病毒剂，但都存在成本高、效能低等问题，为了寻绿高效的抗植物病毒病药剂，农药学家们从植物源和化学合成等方面进行了大量研究，筛选了一些有效的抗病毒药物，然而，并没有开发出一种高效抗病毒剂。因此，寻新型、高效、环境友好的抗植物病毒剂依然是农药研究者面临的一个重大挑战。
3.杂环类化合物在自然界中广泛存在，由于结构多样性决定了性能多样性，在许多具有生物活性的天然产物中以及一些具有药物活性的化合物中都含有杂环结构，杂环化合物已成为药物创制的热点，异噻唑类杂环化合物具有丰富的生物活性，在工业，农业，医药等领域中得到广泛应用。尤其是在农业中的真菌和病毒病害的防治中，异噻唑化合物发挥出重要作用。近年来，发现含有异噻唑杂环的化合物具有较好的抗植物病毒活性和抗真菌活性。
4.1996年，ikeda等(ikeda,k.；ueyama,s.；endo,k；kate,c. isothiazole derivatives,a process for production thereof and uses thereof: u.s.patent 5,484,934[p].1996.)报道了含磺酰基的异噻唑衍生物，对稻瘟病、黄瓜霜霉病、番茄晚疫病、葡萄褐斑病等以及褐腐病、白腐病、干枯病有较好的防治效果。
[0005]
2001年，pilk；ongton等(pilkongton,b.l.；aemstrong,s.；banrnes, n.j.；azine derivates as petcide:wo,001055141[p].2001.报道了n-异噻唑衍生物对蚜虫具有一定的活性，在500μg/ml浓度下，对蚜虫的抑制率为80％-100％。
[0006]
2002年，michelott等(michelotti,e.l.；young,d.h.heterocyclinen-acetonybenzamides and their use as fungicide:ep,1229037[p].2002)报道了含酰胺结构的异噻唑类衍生物的杀菌活性，在100μg/ml浓度下，对腐霉病菌的抑制活性为91.6％，
在300μg/ml浓度下对番茄晚疫病菌的抑制活性为100％。
[0007]
综上所述，异噻唑类衍生物表现出了一定的杀菌和杀虫活性活性。为创制新型高效的抗病毒剂和杀菌剂，本发明在前期工作的基础上，设计合成了系列含n-5-甲基异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，期望筛选出高活性的抗病毒药物和抗菌药物。

技术实现要素：

[0008]
本发明目的在于提供一种含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物及其制备方法。
[0009]
本发明的另一目的在于防治抗烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌、托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌活性的用途。
[0010]
本发明的技术方案是：一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，其通式为下式(i)：
[0011][0012]
其中r1为c1-c3烷基；r2苯基、取代苯基、呋喃基、环己基或戊基。
[0013]
所述的c1-c3烷基为甲基、乙基或异丙基。
[0014]
所述的取代苯基的取代基为卤素、甲基或甲氧基。
[0015]
所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：以4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基) 苯磺酰胺、取代醛、丙二酸酯为原料，以甲苯为溶剂，微波法合成含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的合成方法，其合成路线为：
[0016][0017]
合成步骤和工艺条件为：将4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺、取代醛、丙二酸酯为原料投入单口瓶，加入甲苯，在微波反应器中，反应2-4小时结束，减压回收溶剂，经过柱谱分离得到目标产物。
[0018]
所述的柱谱分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝6:1v/v。
[0019]
所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物在制备防治作物病害的药物和药剂中的应用。
[0020]
所述的作物病害包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌、托拉斯假单胞杆菌和柑橘溃疡病菌和猕猴桃溃疡病菌。
甲氧基苯甲醛(0.001mol)、丙二酸乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(40ml)为溶剂，升温回流，tlc监测反应进程，5小时候结束反应，减压回收溶剂，经过柱谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝8:1v/v)得到目标产物。
[0038]
实施例5：2-(呋喃-2-基((4-(n-(5-甲基异噻唑-3-基)氨磺酰基)苯基)氨基)甲基)丙二酸二乙酯；
[0039]
在100ml单口瓶中，加入4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺(0.001mol)、2-呋喃甲醛(0.001mol)、丙二酸乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(40ml)为溶剂，升温回流，tlc监测反应进程，5小时候结束反应，减压回收溶剂，经过柱谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝8:1v/v)得到目标产物。
[0040]
实施例6：2-(环己基((4-(n-(5-甲基异噻唑-3-基)氨磺酰基)苯基)氨基)甲基)丙二酸二甲酯；
[0041]
在100ml单口瓶中，加入4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺(0.001mol)、环己基甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(40ml)为溶剂，升温回流，tlc监测反应进程，4小时候结束反应，减压回收溶剂溶剂，经过柱谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝8:1v/v)得到目标产物。
[0042]
实施例7：2-(1-((4-(n-(5-甲基异噻唑-3-基)氨磺酰基)苯基)氨基)己基)丙二酸二乙酯；
[0043]
在100ml单口瓶中，加入4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺(0.001mol)、己醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(40ml)为溶剂，升温回流，tlc监测反应进程，5小时候结束反应，减压回收甲苯，经过柱谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝8:1v/v)得到目标产物。
[0044]
对上述实施例i
1-i7合成的含n-噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的收率、物理形态与元素分析如表1所示，核磁共振氢谱(1hnmr)数据如表2所示、核磁共振碳谱(
13
cnmr)数据如表3所示，红外光谱(ir)数据如表4所示，质谱(ms)数据如表5所示：
[0045]
表1目标化合物的理化性质与元素分析
[0046][0047]
表2目标化合物的1hnmr数据
[0048][0049][0050]
表3目标化合物的
13
c nmr数据
[0051][0052]
表4目标化合物的红外数据
[0053][0054][0055]
表5目标化合物的质谱
[0056]
化合物ms(esi):m/zi1518([m+h]
+
),540([m+na]
+
),556([m+k]
+
).i2624([m+h]
+
),644([m+na]
+
),660([m+k]
+
)
i3504([m+h]
+
),526([m+na]
+
),542([m+k]
+
)i4548([m+h]
+
),570([m+na]
+
),586([m+k]
+
)i5508([m+h]
+
),530([m+na]
+
),546([m+k]
+
)i6496([m+h]
+
),518([m+na]
+
),534([m+k]
+
)i7512([m+h]
+
),534([m+na]
+
),550([m+k]
+
)
[0057]
实施例8：目标化合物抗烟草花叶病毒、钝化和保护活性
[0058]
(1)测试方法
[0059]
a.病毒提纯
[0060]
采用gooding方法(gooding；et al.1967)，选取接种3周以上，tmv 系统侵染寄主心叶烟(nicotiana glutinosa l.)植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，1000rpm离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到tmv的粗提液。整个试验在4℃下进行。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
[0061]
病毒浓度(mg/ml)＝(a260
×
稀释倍数)/e0.1％1cm 260nm
[0062]
其中e表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/ml) 的悬浮液，在光程为lcm时的光吸收(光密度)值。tmv的e0.1％1cm 260nm是3.1。
[0063]
b、药剂对tmv侵染的活性作用：选长势一致的心叶烟，先用毛笔蘸取病毒汁液，全叶接种病毒，接种后用清水冲洗。待叶片干后，在右半叶涂施药剂，左半叶涂施对应剂量的溶剂作对照。随后在光照培养箱中保湿培养，控制温度23
±
1℃，光照10000lux，3-4d 后观察并记录产生枯斑的数目。每药剂处理设3株，每株3～4片叶。按上述方法每药剂进行3次重复，按下列公式计算抑制率。
[0064]
c、药剂对tmv侵染的活体保护作用
[0065]
药剂对tmv侵染的活体保护作用：选长势一致的心叶烟，先用毛笔在右半叶涂施药剂，左半叶涂施对应剂量的溶剂作对照，待叶片干后，笔蘸取病毒汁液，全叶接种病毒，接种后用清水冲洗。随后在光照培养箱中保湿培养，控制温度23
±
1℃，光照10000lux，3-4d 后观察并记录产生枯斑的数目。每药剂处理设3株，每株3～4片叶。按上述方法每药剂进行3次重复，按下列公式计算抑制率。
[0066]
d、药剂对tmv侵染的活体钝化作用
[0067]
药剂对tmv侵染的活体钝化作用:选长势一致的心叶烟，向全叶撒匀金刚砂，将化合物与等体积的病毒汁液混合钝化30分钟，用排笔人工摩擦接种于撒有金刚砂的适龄心叶烟右半叶，对应剂量的溶剂与病毒汁液混合接种于撒有金刚砂的适龄心叶烟左半叶，3-4d后观察并记录产生枯斑的数目。每药剂处理设3株，每株3～4片叶。按上述方法每药剂进行3次重复，按下列公式计算抑制率。
[0068]
y＝(c-a)/c
×
100％
[0069]
其中：y为化合物对烟草花叶病毒的抑制率；c为对照组(左半叶)枯斑个数，a为对照组(右半叶)枯斑个数。
[0070]
(2)生物测试结果
[0071]
表6目标化合物对烟草花叶病毒的、保护、钝化活性
[0072][0073]
采用半叶枯斑法，浓度为500μg/ml，以宁南霉素为对照药剂测试了目标化合物的抗tmv活性，从表6生物活性测定结果可以看出含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物对tmv均具有中等到优秀的抑制活性，其中化合物i5在、保护、钝化方面，均优于对照药剂宁南霉素。
[0074]
为了进一步研究含n-5-甲基异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物抗tmv活性，我们测定了该类化合物中i5的ec
50
值，结果见表7。
[0075]
表7部分目标化合物对tmv的活性的ec
50
值
[0076][0077]
结果可以看出，化合物中i5对tmv活性的ec
50
分别为215.9 和181.2μg/ml，优于对照药剂宁南霉素221.1μg/ml
[0078]
实施例9：目标化合物抗黄瓜花叶病毒、钝化和保护活性
[0079]
(1)测试方法
[0080]
a.病毒提纯
[0081]
采用陈瑾的方法(chen,j.；et al.2017)，选取接种3周以上，cmv 系统侵染寄主nicotiana tabacum.l植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经过2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到cmv精提液体。整个实验在4℃下进行，用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度，根据公式计算病毒浓度。
[0082]
病毒浓度(mg/ml)＝(a260
×
稀释倍数)/e0.1％1cm 260nm
[0083]
其中e表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/ml) 的悬浮液，在光程为l厘米时的光吸收(光密度)值。cmv的e0.1％1 cm 260nm是5.0。
[0084]
b、药剂对cmv侵染的活性作用：选长势一直的5-6叶期笕黎打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6
×
10-3mg/ml) 全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。待叶片干后，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度作为对照，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。
[0085]
c、药剂对cmv侵染的活体保护作用
[0086]
药剂对cmv侵染的活体保护作用：选长势一致的5-6叶期笕黎打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应浓度的溶剂作对照，24小后向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6
×ꢀ
10-3mg/ml)全叶接种病毒，用清水冲洗，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。
[0087]
d、药剂对cmv侵染的活体钝化作用
[0088]
药剂对cmv侵染的活体钝化作用:选长势一致的5-6叶期笕黎打顶，向全叶撒匀金刚砂，用磷酸缓冲液将cmv；病毒稀释至6
×ꢀ
10-3mg/ml，将化合物与等体积的病毒汁液混合钝化30分钟，用排笔人工摩擦接种于撒有金刚砂的适龄笕黎左半叶，对应剂量的溶剂与病毒汁液混合接种于撒有金刚砂的适龄笕黎右半叶，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。
[0089]
x％＝(ck－t)/ck
×
100
[0090]
x:相对抑制率(％),
[0091]
ck:未涂施药剂半叶的平均枯斑数
[0092]
t:涂施药剂半叶的平均枯斑数
[0093]
其中，ck与t都采用各组三次重复的平均数
[0094]
(2)生物测试结果
[0095]
表8目标化合物对黄瓜花叶病毒的、保护、钝化活性
[0096][0097]
采用半叶枯斑法，浓度为500mg/l，以宁南霉素为对照药剂测试了目标化合物的抗cmv活性，从表8生物活性测定结果可以看出含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物对cmv均具有中等到优秀的抑制活性，其中i2和i5在、保护、钝化方面，均优于对照药剂宁南霉素。
[0098]
为了进一步研究含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物抗 cmv活性，我们测定了该类化合物中i2和i5的ec
50
值，结果见表7。
[0099]
表9部分目标化合物对cmv的活性的ec
50
值
[0100][0101]
结果可以看出，i2和i5对cmv保护活性的ec
50
分别为180.9和 199.8μg/ml，均优于对照药剂宁南霉素226.7μg/ml。
[0102]
实施例10：目标化合物对轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌的抑制活性
[0103]
(1)测试方法
[0104]
采用离体生长速率法(ye,y.h.；et al.,2014)测定化合物的抑菌活性。加热马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基：马铃薯200g、琼脂 20g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml)至溶融状态(40～60℃)，将10ml 药液(10倍终浓度的药液)倒入90ml pda培养基中，充分摇匀，
均匀倒入直径9cm的培养皿内，水平放置，待冷却凝固。在已经培养 4d的新鲜病原菌菌落边缘用打孔器打取直径为4mm的菌碟，将菌碟倒置于含药剂pda平板中央，然后置于27℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，待空白对照菌落生长至接近平皿三分之二处时开始观测，十字交叉法测量菌落直径，取平均值(宋素琴,等,2004)。空白对照不加药剂，但含有同样浓度的溶剂和0.5％tween 20，每处理重复三次。通过以下公式计算药剂对菌丝生长的抑制率：
[0105]
i(％)＝(c-t)/(c-0.4)
×
100％
[0106]
其中i为抑制率，c为空白对照直径(cm)，t为处理直径(cm)。
[0107]
(2)生物测试结果
[0108]
表10目标化合物对轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌的抑制活性
[0109][0110]
从表10结果可以看出，在50μg/ml浓度下，大多数化合物对轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌表现出较高的抑制活性。其中化合物中i3和i5对轮指孢霉菌和辣椒枯萎病菌的抑制率均高于90％，明显优于商品化对照药剂恶霉灵。
[0111]
实施例11：目标化合物对托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌的抑制活性
[0112]
(1)测试方法
[0113]
采用浊度法(fan,z.j.；et al.,1996)测定化合物的杀菌活性。制备浓度为100μg/ml的被测化合物。配制nb培养基(3.0g牛肉提取物， 5.0g蛋白胨，1.0g酵母粉，10.0g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph 7.0-7.2)，分别用接菌环划一小块含有托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌的培养基放入两个nb培养基中，塞好塞子，在28℃，180rpm恒温摇床振荡培养到生长对数期(od＝0.6-0.8) 备用。取40μl的菌液、4ml水-吐温(1％吐温20)、1ml配制好的化合物溶液，将试管28
±
1℃下培养，并以180rpm连续摇动1-3天。通过测量595nm(od595)处的光密度来监测细菌的生长，但含有同样浓度的溶剂和0.1％tween 20作为空白对照，噻菌铜作为对照药剂，每处理重复三次。通过以下公式计算药剂对细菌的抑制率：
[0114]
i＝(ctur-ttur)/ctur
×
100％
[0115]
其中i为抑制率，ctur代表未经药物处理的试管中细菌生长的校正的浊度值(空白对照)，ttur代表经化合物处理的试管中细菌生长的校正的浊度值。
[0116]
(2)生物测试结果
[0117]
表11目标化合物对托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌的抑制活
性
[0118][0119]
从表11生测活性测试结果可以看出，部分化合物对托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌表现出较好的抑制活性，其中化合物i5对托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌的抑制活性与商品化对照药剂噻菌铜相当。
[0120]
本发明实施例辅以说明本发明的技术方案。本发明效果是合成路线简单、产率较高，得到新型、高效的对烟草花叶病、黄瓜花叶病、食用菌软腐病、辣椒枯萎病、食用菌黄斑病、柑橘溃疡病、猕猴桃溃疡病具有抑制作用的新药。

技术特征：

1.一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，其特征在于：其通式为下式(i)：其中r1为c1-c3烷基；r2苯基、取代苯基、呋喃基、环己基或戊基。2.根据权利要求1所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，其特征在于：所述的c1-c3烷基为甲基、乙基或异丙基。3.根据权利要求1所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，其特征在于：所述的取代苯基的取代基为卤素、甲基或甲氧基。4.如权利要求1所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：以4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺、取代醛、丙二酸酯为原料，以甲苯为溶剂，微波法合成含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的合成方法，其合成路线为：5.根据权利要求4所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：合成步骤和工艺条件为：将4-氨基-n-(5-甲基异噻唑-3-基)苯磺酰胺、取代醛、丙二酸酯为原料投入单口瓶，加入甲苯，在微波反应器中，反应2-4小时结束，减压回收溶剂，经过柱谱分离得到目标产物。6.根据权利要求5所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述的柱谱分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝6:1v/v。7.如权利要求1-4之一所述的一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物在制备防治作物病害的药物和药剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的作物病害包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌、托拉斯假单胞杆菌和柑橘溃疡病菌和猕猴桃溃疡病菌。

技术总结

本发明公开了一种具有农用活性的含异噻唑苯磺酰胺基团的丙二酸酯类化合物，其特征在于：其通式为下式(I)：其中R1为C1-C3烷基；R2苯基、取代苯基、呋喃基、环己基或戊基。所述的化合物具有抗烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、轮指孢霉菌、辣椒枯萎病菌、托拉斯假单胞杆菌、柑橘溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌活性。病菌活性。