一种新型脂肪干细胞提取方法及应用与流程

1.本发明涉及生物制药技术领域，尤其是指一种新型脂肪干细胞提取方法及应用。

背景技术：

2.脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细动物脂肪干细胞。
3.目前在市场及医学领域应用相较比较空缺，从动物脂肪提取的脂肪相较应用比较广泛，主要应用于护肤、美容领域。动物脂肪干细胞所具备的脂肪干细胞特性，是未来作为动物组织工程研究的理想的种子细胞之一，也会随着护肤、医美市场领域需求的提升，最有可能成为脂肪组织工程的种子细胞之一。但是根据目前国内外市场及技术资料调研汇总，动物源脂肪细胞(尤其变温动物脂肪干细胞)是相对比较空缺，基于未来市场的可能需求及目前现技术空缺的现状，本发明提供了一种高效的动物源脂肪干细胞的分离提取方法胞的特点。

技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种新型脂肪干细胞提取方法及应用，能够显著提高脂肪干细胞数量、成活率和活性，应用于人体皮肤抗衰老，效果显著。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
6.一种新型脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
7.s1，提取人体脂肪组织；
8.s2，分离提取脂肪干细胞；
9.s3，将脂肪干细胞进行传代和扩增培养；
10.其中s2中分离提取脂肪干细胞的具体过程如下：对脂肪组织进行清洗-剪碎-消化-再消化-再消化后清洗-裂解红细胞-培养-复种-传代-鉴定。
11.优选地，上述步骤s2中的消化条件为加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min。
12.优选地，上述步骤s2中的再消化操作为：将消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液。
13.优选地，上述步骤s2中传代的具体操作为：每隔3d更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10ml生理盐水洗涤2次，加入5ml胰酶消化液消化1～3min后，加入5ml间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为p0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至p6代。
14.一种新型脂肪干细胞的应用，本脂肪干细胞用于人体皮肤延缓衰老；其具体操作方法为：提取需要的患者的人体脂肪组织，提取脂肪干细胞进行传代和扩增培养，然后将培养好的脂肪干细胞注射回患者体内。
15.本发明的有益效果：
16.本发明能够显著提高脂肪干细胞数量、成活率和活性。应用于人体皮肤抗衰老，效果显著。
具体实施方式
17.为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
18.实施例1
19.分离提取脂肪干细胞的具体方法为：
20.1、对脂肪组织进行清洗：将无菌获取的脂肪组织20ml加入离心管中，用等体积的生理盐水重悬脂肪组织，以转速400～600rpm离心4-8min；使用移液管将脂肪组织层挑取到另一空离心管中，加入等体积的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心4-8min；
21.2、剪碎：将上述清洗之后的脂肪组织挑入另一空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆，再重复上述清洗步骤直至生理盐水呈透明；
22.3、消化：将上述清洗后的脂肪组织匀浆挑入空离心管中，并加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min；
23.4、再消化：将上述步骤3消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液；
24.5、再消化后清洗：收集上述步骤3和4底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液；
25.6、裂解红细胞：加入1～2ml红细胞裂解液，混匀后冰上孵育4～5min，每隔1min振荡一次；加入10～20mlpbs，300～400g离心5～8min，终止裂解，弃上清液；
26.7、培养：在步骤6过滤后的脂肪组织及细胞匀浆中，加入15ml间充质干细胞无血清完全培养基重悬，并将其转移至细胞培养瓶，置于细胞培养箱中37℃培养；
27.8、复种：培养48h后，取细胞培养基上清，置于无菌离心管中，400～500rpm离心8～10min，取出离心后的离心管，弃上清，加入15ml间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，转移至新的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱继续培养；
28.9、传代：每隔3d更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10ml生理盐水洗涤2次，加入5ml胰酶消化液消化1～3min后，加入5ml间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为p0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至p6代；
29.10、鉴定：利用流式检测方法对提取的脂肪干细胞进行表面标记物表达水平进行
检测。
30.实施例2
31.提取需要的患者的人体脂肪组织，按照实施例1中的方法提取脂肪干细胞进行传代和扩增培养，然后将培养好的脂肪干细胞注射回患者体内。
32.本实施例中的所有技术特征均可根据实际需要而进行外观修改。
33.上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种新型脂肪干细胞提取方法，其特征在于：包括以下步骤：s1，提取人体脂肪组织；s2，分离提取脂肪干细胞；s3，将脂肪干细胞进行传代和扩增培养；其中s2中分离提取脂肪干细胞的具体过程如下：对脂肪组织进行清洗-剪碎-消化-再消化-再消化后清洗-裂解红细胞-培养-复种-传代-鉴定。2.根据权利要求1所述的一种新型脂肪干细胞提取方法及应用，其特征在于：上述步骤s2中的消化条件为加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min。3.根据权利要求1所述的一种新型脂肪干细胞提取方法及应用，其特征在于：上述步骤s2中的再消化操作为：将消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液。4.根据权利要求1所述的一种新型脂肪干细胞提取方法及应用，其特征在于：上述步骤s2中传代的具体操作为：每隔3d更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10ml生理盐水洗涤2次，加入5ml胰酶消化液消化1～3min后，加入5ml间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为p0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至p6代。5.根据权利要求1所述的一种新型脂肪干细胞的应用，其特征在于：本脂肪干细胞用于人体皮肤延缓衰老；其具体操作方法为：提取需要的患者的人体脂肪组织，提取脂肪干细胞进行传代和扩增培养，然后将培养好的脂肪干细胞注射回患者体内。

技术总结

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是指一种新型脂肪干细胞提取方法及应用，包括以下步骤：S1，提取人体脂肪组织；S2，分离提取脂肪干细胞；S3，将脂肪干细胞进行传代和扩增培养；其中S2中分离提取脂肪干细胞的具体过程如下：对脂肪组织进行清洗-剪碎-消化-再消化-再消化后清洗-裂解红细胞-培养-复种-传代-鉴定。本发明能够显著提高脂肪干细胞数量、成活率和活性。应用于人体皮肤抗衰老，效果显著。效果显著。