(10)申请公布号 CN 102994435 A
(43)申请公布日 2013.03.27C N 102994435 A
*CN102994435A*
(21)申请号 201210420986.9
(22)申请日 2012.10.29
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/87(2006.01)
C12P 19/26(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(71)申请人江南大学
地址214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号
(72)发明人王小元 韩雅宁 陈久洲 李烨
(74)专利代理机构北京汇信合知识产权代理有
限公司 11335
代理人戴凤仪
(54)发明名称
及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种产单磷酸类脂A 的大肠杆
菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌基因
组中lacl 发生缺失突变失活，lacZ 基因内部敲入
表达外源pagL 、lpxE 以及pagP 基因。本发明构建
的菌株在其生产过程中不涉及致病菌，并且无需
诱导剂，可用于MPL 佐剂的前期大规模生产。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页
1/1页
1.一种产单磷酸类脂A 的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌基因组中lacI 发生缺失突变失活，lacZ 基因内部敲入表达外源pagL 、lpxE 以及pagP 基因。
2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤： 1）将人工构建的lacI 敲除片段转化E.coli W3110，获得突变株E.coli W3110 lacI::Pkan ，通过位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因； 2）将pagL-lpxE-pagP-Fkan 片段电转入步骤1）制备的E.coli W3110△lacI 感受态细胞中，获得E.coli W3110△lacI lacZ::pagL-lpxE-pagP-Fkan ，再次通过位点特异性重组去除其中的卡那霉素抗性基因。 3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述lacI 敲除片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于所述pagL-lpxE-pagP-Fkan 片段片段核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
5.权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于步骤1）所述的位点特异性重组为Cre 酶介导的loxP 位点特异性重组。
6.权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于步骤2）所述的位点特异性重组为FLP 酶介导的FRT 位点特异性重组。
7.权利要求1所述基因工程菌应用于单磷酸类脂A 生产。权 利 要 求 书CN 102994435 A
一种产单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种产单磷酸类脂A（MPL）的基因工程菌，特别是一种无需诱导直接生产MPL的大肠杆菌。
技术背景
[0002] 疫苗佐剂可以非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂，安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫的效果不够理想。因此，人们致力于开发更加高效安全的疫苗佐剂。类脂A 可以被宿主细胞表面的Toll样受体4（Toll Like Receptor 4，TLR-4）识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂。
是一种含有6条及7条脂肪酸链的单磷酸类脂A混合物，其有效结构是3位脱酰基化、2位添加十六碳羟基脂肪酸链的单磷酸类脂A，是已应用于临床试验的脂质体佐剂，人类临床试验的不良反应频率与铝佐剂一样低，其炎症毒性是LPS的0.1%。目前，仅有Corixa公司生产商业化的其生产方法是从沙门氏菌中提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化
等过程。现有生产方法的缺点在于：第一、沙门氏菌是致病菌，操作起来比较困难；第二、该方法涉及到化学处理，步骤繁多，影响产品质量和产量。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种新型的产MPL的基因工程菌，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于MPL佐剂的前期大规模生产。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coli W3110 △lacI lacZ::pagL-lpxE-pagP，其基因组中lacI发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达pagL、lpxE以及pagP基因。
[0005] 类脂A自细胞内膜内侧开始合成，合成途径比较保守，但在转运到外膜外侧的过程中可以发生多种修饰，以适应外界环境。目前，与类脂A结构修饰有关的基因已有报道。利用这些基因，根据类脂A分
子的合成及修饰机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂A 的结构改造成为MPL。
[0006] 所述lpxE来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白质可以水解类脂A分子1位上的磷酸；pagL来源于沙门氏菌，其编码的蛋白质可以水解去除类脂A分子3位的脂肪酸链；pagP 来源于沙门氏菌，其编码的蛋白质可以在类脂A分子β2位上添加一条十六碳脂肪酸链。[0007] 为使外源基因在大肠杆菌中组成型表达，敲除染体上的lacI基因，lacI基因编码lac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白的阻遏作用。
[0008] 本发明还提供了一种利用所述基因工程菌发酵生产MPL的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，MPL的提取方法为：将过夜培养的菌液按初始OD
600
=0.02转接到200mL LB液
体培养基中，37°C培养至OD
600=1时8000rpm离心10min收集菌体，ddH
2
O洗涤菌体一次后
用Bligh-Dyer一相体系（氯仿/甲醇/水，1:2:0.8，v/v/v）悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm 离心20min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27mL 12.5mM的醋酸钠（PH4.5）溶液，超声震荡10min，100°C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系（氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v），2000rpm离心10min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液（4:1，v/v）将类脂A洗出。[0009] 类脂A的检测、分析：
[0010] 薄层层析（TLC）检测：将样品点于Gel 60 TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水（40:25:4:2，v/v/v/v）。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显。
[0011] ESI/MS分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液（4:1，v/v）中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。
附图说明
[0012] 图1野生型大肠杆菌与基因工程菌类脂A TLC分析
[0013] 1:W3110类脂A样品；2：突变株HW002类脂A样品
[0014] 图2基因工程菌类脂A ESI/MS分析
[0015] A:W3110类脂A样品；B：突变株HW002类脂A样品
[0016] 图3野生型大肠杆菌与基因工程菌脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生IL-6的分析
具体实施方式
[0017] 实施例1突变株E.coli W3110 △lacl的构建
[0018] 1、lacI基因敲除片段的获得
[0019] 采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得lacI基因敲除片段，其两端为lacI 基因上下游同源臂、中间为kan片段。lacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将lacI基因敲除片段XhoI、PstI克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒pBlueScript II SK(+)-lacI(U)-pkan-lacI(D)。其中，kan基因两侧带有loxP位点。[0020] 2、敲除感受态的制备及电转化
[0021] 接种带有Red重组辅助质粒pKD46（Datsenko K A,Wanner B L.One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645）的大肠杆菌W3110（ATCC39936）于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C，200rpm过夜培养。按2%接种量转接100mL LB液体培养基，30°C，200rpm培养至OD
=0.2时加入L-阿拉伯糖（终浓度为
600
30mmol/L）诱导重组酶的表达，继续培养至OD
=0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的
600
50mL离心管中，4°C，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用1mL 10%甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。
[0022] 将500-1000ng lacI敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30°C孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30°C培养，挑取转化子于含
30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。[0023] 3、温敏型表达载体pCRE的构建
[0024] 根据NCBI数据库中pSH47(Guldener U,Heck S,Fielder T,Beinhauer J,Hegemann JH.A new effici
ent gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res,1996,24:25192524)载体序列，采用化学全合成或PCR 方法获得cre基因通过SacI、NcoI酶切位点克隆到pKD46质粒多克隆位点，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，30°C过夜培养，挑取转化子提质粒酶切验证，得到Cre重组酶温敏型表达载体，并命名为pCRE。
[0025] 4、突变株抗性标记的去除
[0026] 将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42°C过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37°C培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110 lacI::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入带有重组酶Cre的温敏型表达载体pCRE，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖（终浓度为30mmol/L）诱导Cre重组酶的表达，介导loxP位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42°C热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为W3110△lacI并保藏。[0027] 实施例2突变菌株HW002的构建
[0028] 1、敲入片段pagl-lpxE-pagP-Fkan的获得
[0029] 采用PCR扩增的方法获得分别获得pagL、lpxE、pagP、Fkan基因片段，依次将其克隆到pWSK2
9，获得重组质粒pWSK29-pagL-lpxE-pagP-Fkan。PCR扩增带有lacZ-α天然同源臂的敲入片段pagL-lpxE-pagP-Fkan，其核苷酸序列如SEQ IN NO.2所示。其中，kan基因两侧带有FRT位点。
[0030] 2、敲入感受态的制备及电转化
[0031] 以带有pKD46质粒的W3110△lacI菌株作为出发菌株，制备感受态，方法同前。将500-1000ngpagL-lpxE-pagP-Fkan敲入片段电转入感受态细胞中，通过kan抗性筛选获得染体lacZ基因内部敲入表达pagL-lpxE-pagP-Fkan的突变株W3110△lacI lacZ::pagL-lpxE-pagP-Fkan。
[0032] 3、突变株抗性标记的去除
[0033] 通过转入pCP20质粒（Cherepanov P P,Wackernagel W.Gene disruption in Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.Gene,1995,158(1):9-14），42°C 热激表达FLP酶，介导FRT位点的特异性重组即可去除kan抗性标记，筛选方法同前，得到的突变株命名为HW002并保藏。
[0034] 实施例3突变菌株HW002的类脂A结构分析
[0035] 1、突变菌株HW002的类脂A提取及薄层层析（TLC）分析
[0036] 类脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始
OD
600=0.02转接到200mL LB液体培养基中，37°C培养至OD
600
=1时8000rpm离心10min收
集菌体，ddH
2
O洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系（氯仿/甲醇/水，1:2:0.8，v/v/v）
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