(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810215837.6
(22)申请日 2018.03.15
(71)申请人 东宁波赛东水产品有限公司
地址 157200 黑龙江省牡丹江市东宁市东
宁镇东三线公路南侧
(72)发明人 周浩
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 汤东凤
(51)Int.Cl.
A01K 61/59(2017.01)
A01K 63/04(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种鲜活帝王蟹的暂养方法，是
的环境条件如下：温度1-4℃、盐度35-37‰、
pH7.5-8.5、溶解氧>5mg/L、水位40cm-50cm、氨氮
<0.5mg/L和亚硝氮<0.5mg/L。本发明利用工厂化
暂养设施和精细化管理完成对帝王蟹的长时间
暂养，暂养过程中出现的水体氨氮积累的问题，
采取利用冷水菌培养形成的生物膜构建而成的
生物滤池的方法解决。本发明能提高帝王蟹在暂
养殖领域内对暂养水体无添加、无污染、健康管
理、
产品安全等的需要。权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 108575840 A 2018.09.28
C N 108575840
A
1.一种鲜活帝王蟹的暂养方法，其特征在于，所述的方法是将帝王蟹放入暂养池内进行暂养，其中养殖水体的环境条件如下：温度1-4℃、盐度35-37‰、pH 7.5-8.5、溶解氧>5mg/L、水位40cm -50cm、氨氮<0.5mg/L和亚硝氮<0.5mg/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法，在暂养期间每隔三天投喂一次牡蛎或者贻贝肉。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法是在安装有增氧管道和制冷管道的暂养池内进行的，所述的暂养池通过进水管和出水管与循环水处理系统相连；其中循环水处理系统按照水流方向依次铺设装有吸附碳的尼龙袋和装有珊瑚石的尼龙袋；所述的珊瑚石上附着有用于降解水体氨氮的冷水菌；且在出水管前方安装有紫外消毒装置。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的装有吸附碳的尼龙袋还覆盖有细孔棉毡。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的循环水处理系统还安装有生物膜，生物膜上附着有用于降解水体氨氮的冷水菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的生物膜安放在装有珊瑚石的尼龙袋所在的位置。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的冷水菌为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PDN201601株。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的暂养池中还安装有泡沫分离器。
权 利 要 求 书1/1页CN 108575840 A
一种鲜活帝王蟹的暂养方法
技术领域
[0001]本发明属于海水养殖动物暂养技术领域，具体涉及一种鲜活帝王蟹的暂养方法。
背景技术
[0002]帝王蟹是一类大型甲壳类动物，成体体重1-15kg，栖息于深海低温的水域环境中。帝王蟹富含蛋白质、脂类等营养物质，以其外型美观、肉质鲜美，成为国内市场需求逐年增长的海捕水产品。
[0003]目前，我国市场上的帝王蟹全部来自于国外进口。国外捕捞帝王蟹为季度性捕捞，并有严格的配额限制。由于帝王蟹对水质有较高要求，使其难于长时间暂养，因此无法形成稳定的供应货源，实现全年在中国市场内的供给。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供一种鲜活帝王蟹的暂养方法，能够有效的提高帝王蟹的暂养存活率，从而弥补现有技术的不足。
[0005]本发明所提供的鲜活帝王蟹的暂养方法，是将帝王蟹放入暂养池内进行暂养，其中养殖水体的环境条件如下：温度1-4℃、盐度35-37‰、pH 7.5-8.5、溶解氧>5mg/L、水位40cm-50cm、氨氮<0.5mg/L和亚硝氮<0.5mg/L；
[0006]在暂养期间，每隔三天投喂一次牡蛎或者贻贝肉；
[0007]更具体的，所述的暂养是在安装有增氧管道和制冷管道的暂养池内进行的，所述的暂养池通过进水管和出水管与循环水处理系统相连；其中循环水处理系统按照水流方向依次铺设装有吸附碳的尼龙袋和装有珊瑚石的尼龙袋；所述的珊瑚石上附着有用于降解水体氨氮的冷水菌；且在出水管前方安装有紫外消毒装置；
[0008]作为优选，所述的装有吸附碳的尼龙袋还覆盖有细孔棉毡；
[0009]所述的循环水处理系统还安装有生物膜，生物膜上附着有用于降解水体氨氮的冷水菌；
[0010]所述的生物膜安放在装有珊瑚石的尼龙袋所在的位置；
[0011]所述的冷水菌，其一种为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonasarctica) PDN201601株；
[0012]更进一步的，所述的暂养池中还安装有泡沫分离器。
[0013]本发明利用工厂化暂养设施和精细化管理完成对帝王蟹的长时间暂养，暂养过程中出现的水体氨氮积累的问题，采取利用冷水菌培养形成的生物膜构建而成的生物滤池的方法解决。本发明能提高帝王蟹在暂养过程中的成活率，并保证其活力，且满足海水养殖领域内对暂养水体无添加、无污染、健康管理、产品安全等的需要。
附图说明
[0014]图1：本发明的循环水处理系统结构示意图。
具体实施方式
[0015]申请人对存活率最高的帝王蟹养殖水体进行检测，发现鲜活帝王蟹在温度1-4℃、盐度35-37‰、pH 7.5-8.5、溶解氧>5mg/L、水位40cm-50cm、氨氮<0.5mg/L和亚硝氮<0.5mg/ L的条件下存活率最高。同时申请人筛选获得了适应于帝王蟹生存环境的冷水菌株，从而促成了本发明。
[0016]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0017]实施例1：冷水菌筛选与鉴定
[0018] 1.样品采集
[0019]用无菌头在帝王蟹暂养池水处理系统中的珊瑚石中刮取少量菌膜，涂布于LB固体培养基上，准备进行进一步筛选。 [0020] 2.细菌富集
[0021]用接种环在带回的LB固体培养基上挑取形态大小不同的单菌落置于10mL的LB液体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 30g、pH 7.4～7.6)中，放在摇床(4℃，180r/min)上进行好氧培养，培养72h后，获得纯菌株。最终从固体培养基上挑取并能成功富集的细菌有21株，分别编号为：A11、A31、A32、A41、A42、B11、B21、B22、B31、B32、B33、B41、B42、B51、B52、C11、C12、C21、C22、C31、C32。
[0022] 3.初筛
[0023]配置C/N为15:1的海水氨氮培养基，配方为：海水1000mL、葡萄糖375.00mg、氯化铵38.21mg，使培养基中C、N的浓度分别为150mg/L、10mg/L。
[0024]取培养好的菌液1mL于离心管中，置于离心机4000r/min离心10min，将上清液去掉，用灭过菌的海水冲洗菌体，再用同样的条件离心，去上清液。将菌体接入灭菌后的海水氨氮培养基中，置于摇床(4
℃，180r/min)培养40h后，用靛青蓝分光光度法测量氨氮，以筛选出具有氨氮降解功能的菌株。
[0025]经过初筛，筛选出10株具有氨氮降解功能的菌株，其中B11、B31、B32、B41、B42对氨氮的降解效果最好；8株细菌的海水氨氮培养基中的氨氮浓度高于空白组；3株细菌(B51、B52、B22)由于在海水氨氮培养基中无法生长，因此弃掉。
[0026] 4.复筛
[0027]配置LB液体培养基、海水氨氮培养基、海水亚硝氮培养基，LB液体培养基及海水氨氮培养基的成分同上，海水亚硝氮培养基的配方为：海水1000mL、葡萄糖375.00mg、亚硝酸钠49.28mg，使培养基中C、N的浓度分别为150mg/L、10mg/L。
[0028]选取筛选得到的5株氨氮降解效果好的细菌(B11、B31、B32、B41、B42)作为潜在功能菌株，进行复筛。将细菌接种至LB液体培养基中培养72h，然后按照与初筛相同的方法将细菌离心后分别接至海水氨氮培养基和海水亚硝氮培养基中，置于摇床(4℃，180r/min)培养40h，用靛青蓝分光光度法测定氨氮浓度，用盐酸萘乙二胺分光光度法测定亚硝氮浓度。[0029]实验结果表明：5株细菌(B11、B31、B32、B41、B42)都能够不同程度上降解水体中的氨氮，其中B41的效果最好，在40h时降解率可达62.31％，其次为B11，降解率为57.20％，各菌株对氨氮的降解关系为B41>B11>B42>B32>B31；有2株细菌(B41、B42)对亚硝氮具有较明显的降解效果，降解率分别为39.19％、42.55％，其余3株细菌(B11
、B31、B32)对亚硝氮的降
解效果不明显或无降解效果。
[0030] 5.细菌鉴定
[0031]菌株B41细胞革兰氏染为阴性，且为杆状。在LB固体培养基上形成为圆形菌落，表面干燥，白，不透明。
[0032]对降解氨氮和亚硝氮效果最好的菌株B41进行鉴定。测定B41的16S rRNA的基因序列，并在NCBI中用BLAST进行同源序列比对，然后用MEGA5.0构建系统发育树，确定菌株种类。
[0033]经鉴定，菌株B41与北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)具有最高的相似性，命名为PDN201601进行保藏。
[0034]实施例2：暂养池和循环水处理系统的构建
[0035]本发明的方法包括基础设施建设、生物滤池的构建、日常管理操作三个部分所述的基础设施建设内容包括暂养池的构建和循环水处理系统的构建两个部分。
[0036]暂养池的构建：如图1所示，暂养池的一种具体规格为8m×6m×0.9m，池体厚度为15cm，表面铺设蓝的食品级塑料板，暂养水位控制在40cm-50cm。底部铺设连通方形的增氧管道和制冷管道，暂养池通过进水管和出水管与循环水处理系统相连，其中出水管的水泵效率470L/min，系统24h可循环池水30-40次，另设水管连接立式泡沫分离器，用于清除水体蛋白泡沫。
[0037]循环水处理系统的构建：循环水处理系统紧邻暂养池，通过铁架架高至1m处，处理系统如图1所示，整体为底面5m×1m，高1.5m的长方体PP塑料水箱，距水箱上端5cm处设警戒水位排水管，管口朝向暂养池，以防治水箱内水体的流失。系统内用同质材料纵向均匀隔开5个方形分区，隔板高度1.3m，入水管于第1分区上方进水。第1和第2分区内铺设尼龙网袋装圆柱状吸附碳若干至1m，另第1分区吸附碳袋上方覆盖双层细孔棉毡用以清除大颗粒杂质；第3、第4分区铺设尼龙网袋装长条块状多孔珊瑚石若干，同上高度；第5分区中部设双管紫外灯，出水管连通于底部。
[0038]在将帝王蟹放入暂养池前，进行如下的操作：
[0039]1)菌株培养：将PDN201601的冷水菌在LB培养液中低温4℃培养72h后获得菌体。LB 培养液成分如下：1L蒸馏水中加入30克氯化钠，10蛋白胨，5克酵母粉，pH 7.4-7.8。高温灭菌后接种上述冷水菌在上述条件下培养。
[0040]2)前期挂膜：将整袋的多孔珊瑚石消毒清洗后装入泡沫箱中，每个泡沫箱作为一个处理单元，珊
瑚石体积约占处理单元的30％-40％，加入高氨氮海水，持续充分曝气。将PDN201601菌液均匀泼洒于多孔珊瑚石上，按1g/L浓度添加蔗糖调节碳氮比促进微生物生长。根据需要每次可同时挂生物膜若干组，经4-5天生物膜即培养成熟，成熟后的珊瑚石网袋上有粘液富集，附着菌可达1010cfu/g左右，能快速降解氨氮。
[0041]3)中期发酵：选取高氨氮暂养池为发酵池，目的是将菌株扩大化培养。将成熟的生物膜放入循环水处理系统内，处理单元内的海水全部转移入发酵池。同比例添加蔗糖(1g/ L)，充分持续曝气，经过3-5天左右发酵池成熟。在处理初始氨氮浓度为12.94mg/L池水时，72h后氨氮浓度降到1.97mg/L，去除率高达85％。
[0042]4)后期入池：根据暂养池的数量合理分配发酵池的水体，方法同上。3-4天左右暂养池出现水加深，泡沫增多的情况。通过调大蛋白质分解器，增加充氧，4-5天后上述现象
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