(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811415184.2
(22)申请日 2018.11.26
(71)申请人 贵州医科大学
地址 550025 贵州省贵阳市贵安新区大学
城贵州医科大学
(72)发明人 李红梅 罗小雨 雷霆雯 许庆忠
费烨 张礼林 何晓兰 王筑婷
莫晓川
(74)专利代理机构 西安汇恩知识产权代理事务
所(普通合伙) 61244
代理人 邢立立
(51)Int.Cl.
C07K 7/06(2006.01)
C07K 14/415(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)C07K 1/20(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/16(2006.01)C12P 21/06(2006.01)A61P 3/10(2006.01)A61P 39/06(2006.01)A23L 33/18(2016.01)A23L 33/185(2016.01)
(54)发明名称一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种苦荞抗氧化肽，数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，氨基酸序列分别为Gly -Glu -Val -Pro -Trp、Tyr -Met -Glu -Asn -Phe和Ala -Phe -Tyr -Arg -Trp ，分子量分别为587.0Da 、702.8Da和741.8Da。还提供了苦荞抗氧化肽的制备方法，以苦荞粉为原料制备苦荞清蛋白粉末，然后将苦荞清蛋白粉末进行酶解得到苦荞清蛋白酶解肽，苦荞清蛋白酶解肽经分离纯化得到苦荞抗氧化肽。本发明制备 的苦荞抗氧化肽消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，开发了苦荞的新用途，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能，维持人体自由基的平衡的功效，能在食品和药品上应用，苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的 开发利用。权利要求书2页 说明书9页 附图6页CN 109336953 A 2019.02.15
C N 109336953
A
1.一种苦荞抗氧化肽，其特征在于，所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为70
2.8Da；苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
2.一种制备如权利要求1所述的苦荞抗氧化肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法
向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15min，离心后取上清液，用1M的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所述苦荞粉的质量之比为1mL:1g。
S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法
将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽，命名为TBAH；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4％。
S3、苦荞抗氧化肽的制备方法
S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH；进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ
和TBAH-Ⅲ均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；
S302、阴离子交换谱法：在S301中得到的三种不同重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h； S303、葡聚糖凝胶谱法：在S302中得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2和Fr.2-3，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S304、RP-HPLC反向高效液相谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分，采用RP-HPLC反相高效液相谱进行分离，谱柱为C18柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第
二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1％；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0％开始，至60％结束
洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；
S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测。
3.根据权利要求2所述的苦荞抗氧化肽的制备方法，其特征在于，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。
4.一种如权利要求1所述的苦荞抗氧化肽的应用，其特征在于，将苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3均应用于食品和医药中，尤其苦荞抗氧化肽P3具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性应用于降糖药物中。
一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于抗氧化肽技术领域，具体涉及一种苦荞抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
[0002]苦荞是我国药食同源文化的典型体现，与“何首乌、大黄”等同属蓼科，具有很高的食药两用价值，我国是最早种植苦荞的国家，种植面积最大，产品远销日本，美国和欧洲等地区。然而目前，对于苦荞的研究主要在理化性质上，而苦荞蛋白和生物活性肽的研究很少。
[0003]活性氧和自由基是人体正常生理过程中产生的物质，可以发挥多种功能，如信号传递作用和预防感染，人体本身具有清除自由基的能力，但是在某些情况下，机体不能及时地清除体内产生的自由基从而导致氧化应激的发生，并且可能会进一步引发一系列慢性疾病，如衰老、癌症、心血管疾病和动脉粥样硬化等其他疾病。目前，人们发现通过补充天然或人工合成的抗氧化剂可作为预防机体因氧化应激所造成的生物大分子的系列损伤，但是人工合成的抗氧化剂却对健康有着潜在风险，使用已经开始受到限制。因此，近年来，从天然源中寻新的、安全的抗氧化剂化合物，以替代合成抗氧化剂在食品和医药中的应用成为人们关注的热点。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种苦荞抗氧化肽及其制备方法，本发明消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，所分离得到的抗氧化多肽可以取代传统的合成抗氧化剂，本发明从苦荞粉中提取苦荞清蛋白粉末，再采用酶解、分离纯化的方法得到苦荞抗氧化肽，开发了苦荞的新用途，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能，维持人体自由基的平衡的功效，
本发明的苦荞抗氧化肽能在食品和药品上应用，尤其是苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种苦荞抗氧化肽，其特征在于，所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
[0006]另外本发明还提供了上述的苦荞抗氧化肽的制备方法，该方法包括以下步骤：[0007]S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法
[0008]向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15min，离心后取上清液，用1M的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗
所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所
述苦荞粉的质量之比为1mL:1g。
[0009]S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法
[0010]将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4％。[0011]S3、苦荞抗氧化肽的制备方法
[0012]S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH；进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ和TBAH-Ⅲ均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；[0013]S302、阴离子交换谱法：在S301中得到的三种不同重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
[0014]S303、葡聚糖凝胶谱法：在S302得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2和Fr.2-3，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
[0015]S304、RP-HPLC反向高效液相谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分，采用RP-HPLC反相高效液相谱进行分离，谱柱为C18柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1％；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0％开始，至60％结束洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；
[0016]S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测。
[0017]上述的方法，其特征在于，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。
[0018]优选地，将苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3应用于食品和医药中，尤其苦荞
抗氧化肽P3具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性应用于降糖药物中。[0019]羟基自由基是最主要的活性氧，它能与细胞中几乎所有的物质发生反应，对细胞造成严重的损伤。因此，羟基自由基被认为是所有自由基中的典型代表，被广泛用于监测和
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