[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101570745A [43]公开日2009年11月4日
[21]申请号200810036889.3[22]申请日2008.04.30
[21]申请号200810036889.3
[71]申请人嘉米（上海）生物工程有限公司
地址201821上海市嘉定区福海路1055号4号楼
[72]发明人林澄敏 林再庆 [74]专利代理机构上海开祺知识产权代理有限公司代理人费开逵
[51]Int.CI.C12N 9/38 (2006.01)C12R 1/69 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明提供新型高效制剂乳糖酶的制备方法，
该方法公开了菌种通过一定浓度NTG的处理、生成
高产菌，再在适合于该类微生物生长条件下进行固
条件温和，三废少的特点。
200810036889.3权 利 要 求 书第1/1页
1、一种由菌种发酵制备乳糖酶的方法，其特征在于由下列步骤组成：
a、一种经N T G浓度为100-1000μg/m l溶液浸泡的菌种米曲霉；
b、种子发酵；
c、固体培养发酵；
d、精制分离酶制剂。
2、根据权利要求1所述的制备乳糖酶方法，其特征在于菌种与NTG处理的浓度为100～1000(μg/ml)进行浸泡处理，时间为20～40分钟，反复4～8次。
3、根据权利要求1所述的制备乳糖酶方法，其特征在于种子发酵培养基配方为(重量％)
葡萄糖2～5％、
蛋白胨1～3％、
酵母精0.5～2.5％，
磷酸铵盐0.01～0.10％，
种子培养温度为32～42℃，培养时间为16～40小时。
4、根据权利要求1所述的制备乳糖酶方法，其特征在于固体发酵培养条件为培养基；
小麦麸皮含量为90～98％，
豆饼粉2～10％，
0.1MP灭菌40分钟，采用自动固体发酵机，调节水份至45～65％水份、温度控制在28～38℃，pH4.5～6.8，发酵培养62～68小时进行固体发酵培养。 5、根据权利要求1所述的制备乳糖酶方法，其特征在于通过发酵后的麯用水浸泡，水温25～35度，浸泡时间2～4小时，。被去除所有不溶物后的离心液进行2～6倍的超滤浓缩，最后用0.2um～0.4um膜无菌过滤后获得高浓度的浓缩液，再经过气流干燥成粉剂成品，或通过保存剂的配合获得液体成品。
200810036889.3说 明 书第1/9页
乳糖酶的制备工艺
技术领域
本发明涉及利用微生物技术制备工业用酶制剂，更具体指采用米曲霉经微生物技术制备乳糖酶。
背景技术
酶制剂工业是知识密集型的高科技产业，酶制剂的应用领域极为广泛，酶具有高效、专一反应条件温和的特点，由于它具有如此的特性可以有选择、有控制地通过特定的方式，例水解、氧化还原、裂解、化学基团转移等使被作用对象按预定设想发生化学反应，产生所需目的产品。酶是一种蛋白质，自身可完全生物降解。酶作为具有专一性和高效性的生物催化剂，酶法工艺可替代传统的化学、物理工艺，例如取代化学试剂、减少工业用水、减少能源消耗、减少原材料消耗、提高生产效能。酶制剂的应用，对于提高经济效益，降低资源能耗，促进传统产业的提升，特别是有利于生态环境的改善，符合绿化学的要求。据美国化学协会统计，每年全世界工业用酶制剂市场约30亿美元，世界酶制剂市场以平均30％的速度逐年增长。随着中国改革开放经济的深入发展，酶制剂市场也发生可喜的变化，每年以20％的速度增长，而由于我国目前酶制剂研发和生产处于较为落后的状态，不能满足各行业的生产需求，我国每年需要进口大量昂贵的工业用酶制剂，主要从丹麦、日本、美国等国家进口。 新型高效酶制剂-乳糖酶是一种能分解乳制品中不易被人体吸收的乳糖水解成能被人体正常消化吸收的半乳糖和葡萄糖。可以从根本上解决困扰广大消费者食用乳制品时出现的“乳糖不耐症”的问题。
据有关医学机构近期调查资料表明，我国成人的“乳糖不耐症”的发生
率达75～92％左右，而对于广大乳糖不耐症的人来讲，最简单，最直接的方法是在其食用乳糖食品时，供给外源性的乳糖酶制剂用于对乳糖的水解，促进人体吸收。
众所周知，牛奶是强力健体的最天然、最丰富、最廉价同时最易吸收的食品，国外有“一杯牛奶强壮一个民族”的实例。改革开发以来，我国的乳业生产随着人民生活水平不断提高而迅速发展，2006年液态奶总产量为630万吨，比上年增长32％，按照国际市场消费规律，低乳糖奶按生产总量的10％比例计算，2006年则需生产低乳糖奶近百万吨，按20001的用量计算，则需乳糖酶500吨，加之每年液态奶的消费比重逐年增长，所以乳糖酶市场前景非常可观。同时，本项目产品可以优越的性价比走进国际市场。 从70年代开始，国外就从事于乳糖酶的研发和生产，而我国乳糖酶的研发生产尚属空白阶段，目前国内处于完全依赖进口的局面。本发明生产制备乳糖酶具有酶活性高，反应迅速，产品纯度高，保存稳定性好的特性，产品的各项指标均达到国外同类产品，完全可以取代进口乳糖酶。本项目的开发成功，不仅将提升我国酶制剂行业的技术竞争力，而且填补了国内空白，加速民族工业的发展，并为国家出口创汇作贡献。
用微生物技术研究生产该酶制剂，并使该项目产业化，将提高我国在此领域研究水平，对社会经济效益将会产生具有影响，完全从根本上解决和改善我国乳品加工业的现状，推动我国生物工程在此领域的开发应用。同时乳糖酶在医学行业、保健品等行业具有广泛潜在应用领域。
工业酶制剂的应用，对于提高效率，降低能耗和减少排污有显著效果，是典型的绿化学处理工艺，本发明属生物催化技术的新型高效工业酶制剂，是国家重点支持的研究开发领域，因此具有重大深远的社会经济意义。发明内容
本发明目的是提供一种制备乳糖酶的新工艺。本发明采用用了以下关键技术：
1)采用新型筛选技术，选育高效菌种
微生物发酵是生物工程的重要应用技术，可以生产许多化学法难于生产的产品。高效菌种的选育方法对提高微生物发酵水平，降低生产成本和减少排污量有重要意义。
本发明采用新型筛选技术是利用微生物原始菌种，通过特定的化学方法处理，筛选鉴定出高表达的生产菌种。经筛选的菌种繁殖迅速，发酵活性高，培养时间短，生产效益高，解决了传统的动植物组织提取法原料来源稀缺，提取技术困难，难于实现产业化的问题。
2)采用新型环保发酵原料配方，保护天然资源
本发明采用新型环保发酵原料配方是利用来源广泛，成本低廉的农付产品麸皮、豆饼粉等作为主要发酵配养基，而目前一般酶制剂生产企业采用的液态发酵法，均采用高价位的化工原料及谷物精原料，成本高费用大，消耗天然资源，不利于环保的要求，而本项目所采用的发酵原料主要是用谷物加工后的付产
品物料，生产成本低，节约生物资源，有利环保的绿环保新配方，利用这个独特的配方在特定的发酵培养条件下，生产制备乳糖酶。
3)采用离心超过滤浓缩纯化，减少排污量的清洁生产新技术 酶制剂提取精致工艺一般采用硫酸铵盐折和喷雾干燥的传统工艺，采用硫酸铵盐折工艺生产的酶制剂成品中含有较大含量硫酸铵成分，不符合乳糖加工业的要求，同时成品率低下，仅为50％，而采用喷雾干燥工艺生产的酶制剂在生产过程产生大量废气，严重污染环境，不利于企业发展和环保要求。而本课题研发并采用离心超过滤浓缩新型提取精制方法，使产品的质量得到升级换代，使终端产品符合市场经济发展的要求。同时，避免环境的污染，完全满足环保要求。本课题的该项技术可使工艺收率从50％提高至80％～95％。
4)采用固体发酵，提高资源利用度
目前一般酶制剂企业采用液态大罐进行发酵培养，投资设备成本费用较大，同时在生产培养过程，耗煤耗电耗汽较为严重，不仅使企业生产成本居高不下，同时，消耗资源，破坏环保，严重干扰企业正常生存发展。而本课
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