(10)授权公告号
(45)授权公告日 (21)申请号 201521072130.2
(22)申请日 2015.12.21
A61J 3/00(2006.01)
A61L 27/38(2006.01)
A61L 27/50(2006.01)
A61K 41/00(2006.01)
A61K 9/50(2006.01)
A61K 35/407(2015.01)
A61P 1/16(2006.01)
(73)专利权人上海赛立维生物科技有限公司
地址201203 上海市浦东新区张江高科技园
区碧波路518号304室
(72)发明人吴红平 金晓芳 唐为忠
(74)专利代理机构上海顺华专利代理有限责任
公司 31203
代理人
陆林辉
(54)实用新型名称
(57)摘要
本实用新型涉及组织工程和实验室设备技术
领域，特别涉及一种微流体微囊发生装置。本实用
凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续
相液体对分散相液体的剪切力、表面张力等作用
形成大小稳定的微囊。本实用新型制备得到的人
功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症
因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝
功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞。
(51)Int.Cl.(ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)实用新型专利权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 205252065 U 2016.05.25
C N 205252065
U
1.一种微流体微囊发生装置，其特征在于，该发生装置包括上样推进组件、成囊组件、分离成膜组件；
所述的上样推进组件，包括微量推注泵和三个注射器；
所述的成囊组件，为连续的微流体通道；前端为微流体通道接入端，内置一个连续相通道和两个分散相通道；后端为中空的波形微流体通道；
所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器和旋转成膜台；所述的旋转成膜台由转台和至少六个收集管组成。
2.根据权利要求1所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的微流体通道，采用微加工技术建立微流体通道网络；或者采用针头、聚合物管、中空纤维粘合而成。
3.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的一个连续相通道和两个分散相通道分别与三个注射器相连。
4.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的波形微流体通道最后伸入油水分离器中。
5.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的发生装置还包括移液管。
6.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的发生装置还包括网兜。
7.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的油水分离器底部设置一个磁场发生装置。
权 利 要 求 书1/1页CN 205252065 U
一种微流体微囊发生装置
技术领域
[0001]本实用新型涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种微流体微囊发生装置。
背景技术
[0002]肝衰竭是常见的危重疾病，病情复杂，死亡率高。肝移植是肝衰竭较为有效的方法，但临床
上供体肝来源严重缺乏，很多患者在等待移植的过程中死亡。因此急需实用新型一种切实有效的生物人工肝支持系统，来暂代肝脏功能，给患者自身肝脏恢复创造一个良好的环境，或帮助患者顺利过渡到移植手术期。生物人工肝支持系统中最核心的部分是种子细胞，该细胞能代替肝脏行使代谢、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自体肝细胞，然而到肝病终末期，患者自体肝细胞状态往往很差，难以胜任此工作。国内外研究较多的种子细胞有原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。常用的二维细胞培养模式很难维持这些细胞的功能。
[0003]微囊化细胞培养技术是利用生物兼容性高分子材料形成微囊将细胞包裹在其中实现三维培养的一种技术，形成的微囊可以阻绝免疫细胞及大分子抗体进入囊内，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，能较好的保护囊内细胞维持细胞活性及功能。有学者将微囊化原代猪肝细胞应用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速气流(Sugiura S，Oda T，Aoyagi Y，et a1..Microfabricated airflow nozzle for microencapsulation of living cells into 150micrometer microcapsules[J].Biomed Microdevices，2007，9：91—99)、高压静电(Willaert R G, Baron G V.Gel entrapment and micro—encapsulation：methods,applications and engineering principles[J].Rev Chem Eng.,1996,12:185-205)等微囊发生装置难以得到大小稳定的微囊，且制作成本高，制作过程容易对细胞造成损伤。
[0004]微流体技术是指采用微细加工技术制作出微通道网络结构，或者将各种微细管道把实验室大型设
备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同实验的技术。近些年来，该技术在化学、生物学等领域得到广泛应用，它不仅使试剂的消耗降低，而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势(林炳承，秦建华.微流控芯片分析化学实验室[J].高等学校化学学报,2009,03:433-445)。因此，开发基于微流体的微囊发生装置将简化实验步骤，缩小实验设备，精确控制微囊大小，减小微囊制作过程对细胞造成伤害。
[0005]海藻酸钠凝胶因具有生物相容性好、细胞毒性较低、无免疫原性、可被生物降解、可以在适宜的条件下加工成形等优点，正被广泛应用于制作生物医学领域的微囊，例如甲状腺细胞、胰岛细胞、肝细胞的包囊(Prakash S.Artificial cell therapy：New strategies for the therapeutic delivery of live bacteria[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2005，44—56)。单纯的海藻酸钠微囊化肝细胞，较传统的二维细胞培养模式能更好的维持肝细胞功能。但由于肝细胞生长的特殊性，例如贴壁生
长、需要胶原支撑等，单纯的海藻酸钠微囊尚无法长时间维持其功能，离应用于生物人工肝系统还有一段距离。
实用新型内容
[0006]本实用新型的目的在于提供一种微流体微囊发生装置，具体是一种人工肝细胞用微流体微囊发生装置。
[0007]本实用新型的主要技术方案包括，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体(如豆油)对分散相液体(如海藻酸钠与氯化钙)的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊，并且在海藻酸钠凝胶中加入了胶原和磁性物质，让其更适合种子细胞三维生长和应用于生物人工肝支持系统。
[0008]为实现上述目的，本实用新型通过以下技术方案实现：
[0009]本实用新型的第一方面，提供了一种微流体微囊发生装置，包括上样推进组件、成囊组件、分离成膜组件；
[0010]所述的上样推进组件，包括微量推注泵和三个注射器；
[0011]所述的成囊组件，为连续的微流体通道；前端为微流体通道接入端，内置一个连续相通道和两个分散相通道；后端为中空的波形微流体通道；
[0012]所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器和旋转成膜台；所述的旋转成膜台由转台和至少六个收集管组成。
[0013]所述的微流体通道，包括采用硅、或玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷微流体芯片经微加工技术建立微流体通道网络或选择各种针头、聚合物管、中空纤维等粘合而成。
[0014]所述的一个连续相通道和两个分散相通道分别与三个注射器相连；
[0015]所述的波形微流体通道最后伸入油水分离器中；
[0016]本实用新型的一种微流体微囊发生装置，还包括移液管，用于将油水分离器中分离得到的微囊移至旋转成膜台。
[0017]本实用新型的一种微流体微囊发生装置，还包括网兜，用于盛接移液管移来的微囊，并放置于旋转成膜台的收集管中。
[0018]本实用新型的一种微流体微囊发生装置，所述的油水分离器底部设置一个磁场发生装置。
[0019]本实用新型还提供了利用上述的微流体微囊发生装置制备人工肝细胞微液体微囊，所述的人工肝细胞微流体微囊制备方法包括以下步骤：
[0020]A、海藻酸钠混合溶液的制备：
[0021]本步骤中的海藻酸钠混合溶液，为海藻酸钠混悬溶液未加种子细胞的溶液(即海藻酸钠混合溶液加种子细胞后称为海藻酸钠混悬溶液)。
[0022]用生理盐水溶解海藻酸钠配制1.5％-2.0％(质量浓度)的海藻酸钠溶液，混入磁性物质，使磁性物质在海藻酸钠溶液中的比例为1-5mg/mL(重量体积比，W/V，优选2mg/mL)，将此混合物用钴60照射除菌；
[0023]再以1：15-30(优选1：26)的体积比加入Matrigel基质胶，混合均匀，4℃冰箱保藏备用；
[0024]B、微囊的制备
[0025]分散相一，为种子细胞充分混匀于步骤A得到的海藻酸钠混合溶液中得到分散相一(AS)；
[0026]分散相二，氯化钙(IS)，除菌；
[0027]连续相，为不溶于水的油性介质(OI)，如大豆油、甲基硅油等，除菌；
[0028]将AS、IS、OI分别装入注射器中，用微量推注泵推注入微流体通道中；
[0029]在微流体通道中形成微囊后进入油水分离器，待微囊表面形成一层钙化的外膜后，进行油水分离，并用生理盐水洗涤；
[0030]移至旋转成膜台，优选的用网兜兜住微囊后，依次通过0.1％多聚赖氨酸溶液——生理盐水——0.
15％海藻酸钠溶液——生理盐水——55mmol/L的柠檬酸钠溶液——生理盐水，得到最终的微囊——人工肝细胞微流体微囊。
[0031]上述的人工肝细胞微流体微囊制备方法，还包括步骤C、将步骤B获得的微囊置于37℃、5％CO2培养箱中孵育。
[0032]所述的种子细胞为原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。
[0033]步骤B得到的最终的微囊，结构是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微囊。
[0034]步骤B中的油水分离，在本实用新型的一个优选实施例中，在油水分离器底部添加一个大小0.5-1T(优选为0.6T)的磁场，更易于油水分离，并且在外加磁场条件下，可进一步缩短混合微囊的沉降时间，表现出良好的磁响应性。
[0035]步骤B得到的最终的微囊，粒径以50—500μm为优，直径500μm左右的微囊可应用于生物人工肝支持系统，直径50μm左右的微囊可应用于细胞。
[0036]步骤B中所得微囊在油水分离器中放置10min左右，可在微囊表面形成一层钙化的外膜。
[0037]所述的步骤A中，对微囊成分进行了改进，包括加入胶原与磁性物质。所述胶原为对维持肝细胞功能有益的胶原，如Matrigel基质胶。所述磁性物质为粒径在10nm～100μm的铁磁性物质或顺磁性物质，如铁、镍、四氧化三铁等。
[0038]所述的步骤B中，分散相包括海藻酸钠溶液和二价离子溶液；所述海藻酸钠溶液为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠。所述二价离子溶液为能与海藻酸钠固化成囊的二价离子溶液，如氯化钙溶液。
[0039]所述的步骤B中，本实用新型的微流体通道，可通过微流体芯片经微加工技术建立微流体通道网络或选择各种针头、聚合物管、中空纤维等粘合而成。包括一个连续相入口，注入油相液体(简称OI)；两个分散相入口，一个注入二价离子溶液(简称IS)，一个注入种子细胞与海藻酸钠的混悬溶液(简称AS)；一个出口，将形成的微囊排出。IS与AS需以相同流速，同时达到通道内。OI流速比分散相的要快，从而可以在IS与AS相遇接触的瞬间将其固化物夹断，形成微囊。可以通过控制OI流速与分散相流速和调整通道直径来精密控制微囊的大小。较优的，分散相以100ul/min的速度推注，连续相以55ml/h的速度推注。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议