(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410128463.6
(22)申请日 2014.04.01
C07K 7/08(2006.01)
C07K 16/00(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
(71)申请人上海中信国健药业股份有限公司
地址201203 上海市浦东新区张江高科技园
区李冰路399号
(72)发明人张玉晶 倪宝富 高宏海
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种用于蛋白质表达的信号肽，
具体地，本发明涉及用于引导外源蛋白质（如抗
号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的信号
肽可添加于哺乳动物细胞重组蛋白（如抗体）的表
达载体，用于引导外源蛋白的高效分泌表达。与
现有信号肽相比，本发明信号肽引导的外源蛋白
表达量得到了大幅提升。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书5页序列表5页 附图5页
(10)申请公布号CN 104974226 A (43)申请公布日2015.10.14
C N 104974226
A
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1.一种人工合成的信号肽，其特征在于所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述信号肽用于在哺乳动物宿主细胞中引导外源蛋白的分泌表达。
3.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述信号肽。
4.根据权利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列为SEQ IDNO:7所示。
5.一种哺乳动物细胞表达载体，所述哺乳动物细胞表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸及编码外源蛋白的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，权利要求3或4所述多核苷酸紧接在所述编码外源蛋白的多核苷酸前端。
7.根据权利要求5-6所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体的启动子选自EF-1α启动子、hCMV 启动子、SV40启动子或者EF-1α与hCMV 启动子的杂合启动子等。
8.根据权利要求5-6所述外源蛋白，其特征在于，所述外源蛋白选自抗体、融合蛋白或者非融合蛋白。
9.一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为权利要求5-7任一所述表达载体所转染。
10.根据权利要求9所述哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞为CHO 、BHK 、SP2/0、C127或HEK293细胞。
11.根据权利要求10所述哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述细胞是CHO 细胞。
12.一种外源蛋白质的生产方法，为在适合表达哺乳动物来源的蛋白质的条件下，培养权利要求10或11所述重组哺乳动物细胞，而后从培养物中分离出所述哺乳动物来源的蛋白质。权 利 要 求 书CN 104974226 A
一种用于蛋白质表达的信号肽
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于引导外源蛋白质（如抗体）在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。
技术背景
[0002] 2007年我国基因重组蛋白类药物取得较快发展，在基因组技术的上游阶段，利用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，结合新的融合蛋白载体的构建，有效的提高现有重组蛋白药物的半衰期和可溶性等特性，为工业化制备提供了新的工艺，从而提高了重组蛋白的回收率；但在下游的分离纯化技术和哺乳细胞表达系统的表达和纯化能力方面，仍存在较大差距。特别是现代生物医药的重要组成部分——抗体，抗体针对相应抗原具有高特异性和高亲和力的特性，使得其在疾病的诊断和中显示出其他类型药物无可比拟的优势。抗体药物经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体的发展，抗体药物向低抗原性、高特异性方向发展。抗体制备方法经历了常规血清技术、杂交瘤技术、基因工程抗体技术及抗体库技术。使用体外筛选技术与转基因动物筛选获得全人源抗体成为抗体研究的主要方向。利用哺乳动物细胞表达蛋白质（如抗体）成为蛋白质生产的主流，但哺乳动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高哺乳动物细胞外源蛋白表达效率，降低生产成本是当前工作中的重中之重。
[0003] 工业上，蛋白质（如抗体）的表达水平受很多因素影响，如表达载体、宿主、培养基、培养工艺
等。而表达载体的表达能力又受启动子、信号肽等因素影响，其中信号肽在蛋白质（如抗体）的分泌表达过程中扮演着至关重要的作用，直接影响分泌蛋白质的质量。[0004] 信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端；一个中间疏水序列，以中性氨基酸为主，能够形成一段α螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，
[0005] 新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。信号肽分泌外源蛋白的作用如下：
[0006] 1）信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞。
[0007] 2）信号肽的疏水核心决定蛋白质的分泌效率。
[0008] 3）信号肽能够引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确的定位。[0009] 4）信号肽能够分泌增强子增强外源蛋白的分泌。
[0010] 5）短的信号欣有利于减少表达载体的分子置，提高整合到宿主染体上外源基因表达盒的
[0011] 稳定性和转录效率。
[0012] 同一种蛋白在不同信号肽的作用下，即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚
远。如Nagarajan选择了枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢杆菌RNA酶(barnase)和果聚糖蔗糖酶等4种酶的信号肽，以芽孢杆菌BE1510为宿主菌，分别研究它们对重组链霉抗生物素蛋白(stre ptavidin)分泌效果的影响。结果表明，携带4种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生物素蛋白，但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高。适当改造信号肽结构可提高外源蛋白的分泌效率。对于外源蛋白（如抗体），选择合适的信号肽可以将其表达量成倍提高，无论对于工业生产还是科学研究，其意义都是非常深远的。
发明内容
[0013] 本发明目的是提供一种可以引导外源蛋白质（如抗体）高效表达的信号肽，以降低外源蛋白的生产成本。
[0014] 首先，本发明提供了一种人工合成的用于引导外源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
[0015] SEQ ID NO:1MGKWVKVLFALICIAVAYS
[0016] 所述的哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）、幼年仓鼠肾细胞（baby hamster kidney，BHK）、小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）、小鼠乳腺肿瘤细胞(C127)、人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293）等。
[0017] 本发明的信号肽可用于在哺乳动物宿主细胞中引导外源蛋白（如抗体）的分泌表达。
[0018] 本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述用于引导外源蛋白（如抗体）在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。
[0019] 进一步的，所述多核甘酸的序列为SEQ ID NO:7：
[0020] ATGGGAAAATGGGTGAAAGTGCTGTTTGCCCTGATCTGTATTGCAGTGGCATATAGC（SEQ IDNO:7）[0021] 本发明的多核苷酸可通过常规的合成方法制备。
[0022] 本发明的多核苷酸可添加于哺乳动物细胞表达载体，用于引导外源蛋白的分泌表达。
[0023] 利用本发明的信号肽在动物细胞中分泌表达蛋白质（如抗体）的方法为：将编码本发明信号肽的多核苷酸与编码表达蛋白质（如抗体）的多核苷酸连接后克隆入哺乳动物细胞表达载体，而后将该重组哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物细胞后表达目的蛋白。[0024] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有前述编码本发明信号肽的多核苷酸及编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸。
[0025] 所述表达载体中，编码本发明信号肽的多核苷酸紧接在所述编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸前端。本发明引用了天然抗体信号肽进行对比，氨基酸序列为SEQ ID NO:2-6。
[0026] SEQ ID NO:2METPAQLLFLLLLWLP(GenBank:AAA36085.1,Homo sapiens)
[0027] SEQ ID NO:3MGWSCIILFLVATATGVHS(GenBank:CAA25967.1,Mus musculus) [0028] SEQ ID NO:4MGWSCIILFLVATATG（GenBank:AAA38605.1,Mus musculus）[0029] SEQ ID NO:5MSVPTQVLGLLLLWLTDARC（GenBank:CAB46315.1,Mus musculus）[0030] SEQ ID NO:6MDMRVPAQLLGLLLLWLPG（GenBank:AAA58934.1,Homo sapiens）[0031] 所述表达载体的启动子可以是EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、
hCMV（human cytomegalovirus）启动子、SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子、SV40早期启动子或者EF-1α与hCMV启动子的杂合启动子等。
[0032] 如本发明实施例列举的，所述表达载体为Freedom pCHO1.0。
[0033] 本发明还提供了一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为前述表达载体所转染。所述的哺乳动物细胞可选自CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。
[0034] 所述外源蛋白可以为任意蛋白质，如抗体、融合蛋白或者非融合蛋白等
[0035] 本发明将本发明信号肽与天然抗体信号肽进行比较，外源蛋白表达量的测定结果表明，本发明的信号肽特别适用于CHO细胞的外源蛋白表达，与现有信号肽相比，在动物细胞中的外源蛋白（如抗体）表达量获得大幅提升，表达水平提高了2倍以上，其应用有利于筛选到高表达单克隆细胞株，并可以降低生产成本。
附图说明
[0036] 图1Freedom pCHO1.0表达载体图
[0037] 图2本发明信号肽与天然抗体信号肽引导的外源蛋白表达量对比图
[0038] 图3利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的纯度
[0039] 图4利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的轻链N端测序图谱
[0040] 图5利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的重链N端测序图谱
[0041] 图6利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的完整分子量图谱
具体实施方式
[0042] 下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制
[0043] 本发明实施例所列举的表达载体为Freedom pCHO1.0（购自invitrogen）。[0044] 实施例1信号肽的合成
[0045] 因信号肽较短，将信号肽按引物合成。每条信号肽5’端都分别添加单独AvrII、EcoRV酶切位点，即一条信号肽合成含有一个酶切位点；每条信号肽3’端添加部分与目的基因序列相同的片段，便于拼接。信号肽核苷酸序列如下。
[0046] 信号肽1：ATGGGAAAATGGGTGAAAGTGCTGTTTGCCCTGATCTGTATTGCAGTGGCATATAGC（SEQ ID NO:7）
[0047] 信号肽2：ATGGAAACCCCTGCTCAGCTCCTCTTCCTGCTCCTCCTCTGGCTCCCA（SEQ ID NO:8）[0048] 信号肽3：ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGCGTCCACAGC（SEQ ID NO:9）
[0049] 信号肽4：ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGA（SEQ ID NO:10）
[0050] 信号肽5:ATGAGCGTCCCAACACAAGTGCTGGGTCTGCTGCTGCTGTGGCTGACTGACGCAAGGTGC （SEQ ID NO:11）
[0051] 信号肽6：ATGGATATGAGGGTGCCCGCTCAACTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGCCAGGC（SEQ ID NO:12）
[0052] 实施例2重组pCHO1.0表达载体的构建
[0053] 将经过密码子优化的贝伐单抗基因重链（WO2004/065417,SEQ ID NO:24，3’
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