[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101671651A [43]公开日2010年3月17日
[21]申请号200810042695.4[22]申请日2008.09.09
[21]申请号200810042695.4
[71]申请人上海交通大学医学院附属第九人民
医院
地址200011上海市黄浦区制造局路639号
[72]发明人匡延平 彭秋平 [74]专利代理机构上海翼胜专利商标事务所(普通合伙)代理人翟羽 何兴元
[51]Int.CI.C12N 5/08 (2006.01)C12M 3/00 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 3 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明提供一种操作简便、容易寻精子、精
子存活率高、精子回收率高的精子的冷冻和解冻方
法，同时，也提供了一套用于上述方法中的装置。
本发明的主要优点是：(1)精子置于微滴中，在油
中解冻，精子不会丢失，精子回收率接近100％；
(2)冷冻液中含有甘油，精子存活动率可达90％；
(3)操作相比现有技术简便易行。本发明很好地解
决了目前精子冻存技术中出现的严重少弱精子、睾
丸、附睾精子冻存后精子回收容易失败的难题，使
无精子症患者接受辅助生育的灵活性极大提高。
200810042695.4权 利 要 求 书第1/2页 1、一种精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，其包含以下步骤： (1)少量精子的冷冻：制备含有甘油的冷冻液，恒湿条件下在冷冻片的片部上做一个微滴，显微操作用针将少量精子放入微滴中，套上冷冻套，缓慢进入液氮蒸气中，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存；
(2)少量精子的解冻：将冷冻片从液氮中取出，置入37摄氏度矿物油中复温，镜下寻精子，用注射针将精子转移至人输卵管液微滴中备用。
2、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，步骤(1)中的冷冻片包含一杆部以及一片部，所述片部为长片状或者槽状。
3、如权利要求2所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，当冷冻片为槽状时，可在所述微滴上盖油保湿。
4、如权利要求2所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。
5、如权利要求4所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。
6、如权利要求1-3任意一项所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，实现步骤(1)中所述的恒湿条件需准备一个湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。
7、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述湿盒内加水以保持湿度。
8、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。
9、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。
200810042695.4权 利 要 求 书 第2/2页 10、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，其中，在步骤(1)中，冷冻套内还设有用于维持恒湿条件的湿润棉花。
11、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，在步骤(2)中，在冷冻片置入矿物油后，在冷冻片上放置一可压住冷冻片的小重物。
12、一种用于权利要求1所述方法的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，该装置为：
一种可承载精子的冷冻片，所述冷冻片包含杆部和片部，所述片部为长片状或者槽状，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。
13、如权利要求12所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述的精子的冷冻和解冻装置还包括一种可以制造恒湿条件的湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。
14、如权利要求13所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。
15、如权利要求13所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。
16、如权利要求12所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。
200810042695.4说 明 书第1/6页精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置
技术领域
本发明涉及医学中的辅助生育领域，涉及少量睾丸精子、附睾精子的冷冻和解冻方法以及用于上述方法中的装置。 背景技术
现代辅助生育技术能对少精症或无精症患者(通过睾丸、附睾活检获得少量精子)进行卵细胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)而获得子代。由于每个ICSI周期的妊娠率在35％-40％，为了获得妊娠，部分患者需要重复数次ICSI。如果没有对其精子冻存，每个周期都要排精或进行睾丸、附睾活检。少精症者精子不稳定，可能得不到精子以致本周期失败，而睾丸、附睾活检是创伤性手术，多次反复操作不但给患者带来额外的心理压力和经济负担，而且还可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，甚至内分泌功能丧失而需要外源性睾酮替代。但如果能将排出的少量精子或睾丸、附睾活检得到的精子冷冻，在平常或诊断性睾丸、附睾活检时即可进行精子的制备和冻存，可以大大提高这类患者辅助生育的灵活性。
中国专利申请200510061871.5号提供一种睾丸精子的冻存与复苏方法，该发明提供睾丸精子的冻存与复苏方法，以胞浆抽空的透明带为载体，将活检的睾丸精子装入封闭的透明带内，进行精子冷冻保护剂的添加和洗脱，冻存复苏过程中精子封闭保存于透明带内，该方法中透明带精子复苏不必经过繁锁的不连续密度梯度分离及洗涤离心过程，可直接在显微操作仪下吸出精子，直接用于ICSI。
200810042695.4说 明 书 第2/6页 但是在上述方法中，以冷冻麦管，空透明带、冷冻环等装载精子，不少精子在操作过程中丢失，造成得到的精子数量少，活动力低，常规冻存复苏后，往往难以到活精子进行ICSI。因此，在临床操作中冻存精子回收失败甚至放弃冷冻是辅助生育临床的常见问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、容易寻精子、精子存活率高、精子回收率高的精子的冷冻和解冻方法，同时，也提供了一套用于上述方法中的装置。本方法所述的步骤如下所述。
一种精子的冷冻和解冻方法，其包含以下步骤：
(1)少量精子的冷冻：制备含有甘油的冷冻液，恒湿条件下在冷冻片的片部上做一个微滴，显微操作用针将少量精子放入微滴中，套上冷冻套，缓慢进入液氮蒸气中，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存；
(2)少量精子的解冻：将冷冻片从液氮中取出，置入37摄氏度矿物油中复温，镜下寻精子，用注射针将精子转移至mHTF(人输卵管液)微滴中备用。 其中，实现步骤(1)中所述的恒湿条件需准备一个湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。所述湿盒内加水以保持湿度。所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。 其中，步骤(1)中的冷冻片包含一杆部以及一片部，所述片部为长片状或者槽状，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。当冷冻片为槽状时，可在所述微滴上盖油保湿。
其中，在步骤(1)中，冷冻套内还设有用于维持恒湿条件的湿润棉花。 其中，在步骤(2)中，在冷冻片置入矿物油后，在冷冻片上放置一可压住
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