(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201811624401.9
(22)申请日 2018.12.28
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 110194787 A
(43)申请公布日 2019.09.03
(66)本国优先权数据
201810113195.9 2018.02.05 CN
地址 100050 北京市西城区南纬路甲2号
(72)发明人 胡卓伟 花芳 尚爽 杨雨薇
余娇娇 周丹丹 张诚
(51)Int.Cl.
C07K 7/08(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
A61K 38/10(2006.01)
A61K 47/64(2017.01)A61P 35/00(2006.01)(56)对比文件CN 104211765 A ,2014.12.17CN 106279390 A ,2017.01.04US 2010209426 A1,2010.08.19US 7067474 B1,2006.06.27吴穹.DKK1合成多肽对骨质疏松症和成骨作用的研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》.2017,E065-82.审查员 王芳 (54)发明名称
及其用途
(57)摘要
本发明公开了一种靶向抑制β‑catenin的
的药物中的应用。所述多肽具有下列氨基酸序
列：ARM7:Leu ‑His ‑Tyr ‑Gly ‑Leu ‑Pro ‑Val ‑Val ‑
Val ‑Lys ‑Leu ‑Leu ‑His ‑Pro ‑Pro该多肽是通过表
面等离子共振(Biacore)的方法筛选出来，具有
与TRI B3特异性结合，并能阻断TRI B3和β‑
catenin蛋白结合的能力，抑制Wnt/β‑catenin
生长和转移。因此本发明多肽及其衍生物应用于
和预防肿瘤的药物制备中。所制备的药物可
用于肿瘤，例如结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、
胶质瘤及乳腺癌等。权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图2页CN 110194787 B 2022.05.17
C N 110194787
B
1.一种能与TRIB3特异性结合的多肽及其多肽衍生物，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述的多肽衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。
2.权利要求1的多肽及其多肽衍生物在制备靶向抑制β‑catenin转录活性的药物中的应用。
3.权利要求1的多肽及其多肽衍生物在制备肿瘤药物中的应用；
所述的肿瘤选自结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌及乳腺癌。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述的肝癌为原发性肝癌或继发性肝癌；所述的肺癌为非小细胞肺癌或小细胞肺癌；所述胰腺癌为胰腺导管腺癌、胰腺腺泡细胞癌；所述乳腺癌为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有如权利要求1的多肽及其多肽衍生物或其药学上可接受的载体或赋形剂。
6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
权 利 要 求 书1/1页CN 110194787 B
靶向抑制Wnt/β‑catenin信号活性的多肽及其用途
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备和预防肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002]Wnt/β‑catenin信号通路于多种肿瘤(结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胶质瘤及乳腺癌)中都存在异常活化，在肿瘤发生、肿瘤增殖、肿瘤转移、肿瘤休眠、肿瘤免疫、肿瘤耐药及维持肿瘤干性等方面都发挥促进作用。β‑catenin作为该信号通路的效应分子，通常会被其降解复合物成员Axin‑2、APC及GSK‑3β等磷酸化，进而进入泛素化途径降解。而当Wnt信号异常激活时，β‑catenin降解复合物成员解体，细胞浆内堆积的β‑catenin会转位位进入细胞核内与LEF/TCF家族形成转录复合物，共同促进多种致癌因子的转录，从而促进肿瘤的发展进程。
[0003]目前，针对该通路的靶向抑制剂主要包括小分子药物、抗体类药物、RNA干扰药物及天然产物。在为期三十多年的研究中，除少数药物进入临床试验外，多数药物仍处于临床前研究当中，尚未见靶向药物上市。在研药物作用类型主要分为四种：抑制配基Wnt‑3a与细胞膜表面受体LRP5/6及Frizzled的结合；降低β‑catenin的蛋白表达水平；抑制β‑catenin 的细胞核转位；抑制细胞核内β‑catenin/TCF转录复
合物的活性。由于Wnt‑3a与受体结合这一过程并不是导致β‑catenin升高的唯一因素，如在多种结肠癌中β‑catenin本身或者其降解复合物组分APC的突变是诱导该通路异常激活的关键步骤，所以第一类药物普适性不强。第二类药物主要为GSK‑3β、Axin‑2、PKA等β‑catenin降解复合物成员的激动剂，同样由于β‑catenin等上游信号蛋白的突变，使这种类型药物的应用也存在局限性；此外由于β‑catenin在生理状态下维持细胞膜及细胞骨架的正常结构，故下调β‑catenin的蛋白水平可能存在较大风险。所以对β‑catenin的调控重心应该放在抑制β‑catenin入核或抑制其在细胞核内转录复合物的活性这两个方面。目前由于入核抑制剂的靶向专一性不强，使这类药物的开发难度大大增加。而一些打断β‑catenin及转录辅因子TCF4相互作用的化合物或多肽药物直接作用于该信号通路的下游分子，靶向性强、副作用小，具有良好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。但由于β‑catenin与TCF4蛋白相互作用面积过大，小分子药物的介入不能起到较好的打断作用。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对Wnt/β‑catenin信号通路调控机制复杂，药物研发进程缓慢，缺乏抑制β‑catenin转录激活活性的有效药物，提供一种通过打断β‑catenin/TRIB3相互作用进而减弱β‑catenin/TCF4转录活性的多肽及其在制备和预防肿瘤的药物中的应用。该多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列，具体序列如下: [0005]ARM7:Leu‑His‑Tyr‑Gly‑Leu‑Pro‑Val‑Val‑Val‑Lys‑Leu‑Leu‑His‑Pro‑Pro [0006]本发明的氨基酸序列
还包括在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与
TRIB3特异性结合的寡肽序列。本发明的多肽及其衍生物用于靶向与TRIB3相关的疾病。基于发明人的研究工作，本发明提供下述的技术方案。
[0007]本发明提供的技术方案之一是：一种能与TRIB3特异性结合靶向抑制β‑catenin转录活性的多肽及其多肽衍生物、其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列，具体序列为Leu‑His‑Tyr‑Gly‑Leu‑Pro‑Val‑Val‑Val‑Lys‑Leu‑Leu‑His‑Pro‑Pro，或其任何位置进行氨基酸替换、缺失或添加得到的有相同功能的序列；所述的多肽衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽(细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用)连接所形成的嵌合肽，。
[0008]本发明提供的技术方案之二是：本发明技术方案之一所述的多肽及其多肽衍生物在制备靶向抑制β‑catenin转录活性的药物中的应用，以及所述多肽在制备和/或预防肿瘤的药物中的应用。
[0009]所述的肿瘤为本领域常规的肿瘤。较佳的是结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌及乳腺癌。所述肠癌为本领域常规的肠癌，较佳的为结肠癌或直肠癌；所述的肝癌为本领域常规的肝癌，较佳的为原发性肝癌或继发性肝癌；所述的肺癌为本领域常规的肺癌，较佳的为非小细胞肺癌或小细胞肺癌；所述胰腺癌为本领域常规的胰腺癌，较佳的为胰腺导管腺癌、胰腺腺泡细胞癌；所述乳腺癌为本领域常规的乳腺癌，较佳的为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌。
[0010]所述预防是本领域常规的预防，较佳的指存在可能的肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生。所述时本领域常规的，较佳的指减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓肿瘤的进程。
[0011]本发明提供的技术方案之三是：一种药物组合物，其含有所述的靶向抑制β‑catenin转录活性多肽或其多肽衍生物作为活性成分。
[0012]所述的活性成分是指具有预防或肿瘤功能的化合物。在所述药物组合物中，所述靶向抑制β‑catenin转录活性的多肽可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
[0013]本发明所述的药物组合物的给药途径较佳的为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳的为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
[0014]较佳地，本发明所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。所述的载体或赋形剂为本领域常规药用载体或赋形剂，所述的载体或赋形剂可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述多肽和0.01～99.99％的药用载体或赋形剂，
所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0015]较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待症状和所寻求结果的考虑。
[0016]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实
例。
[0017]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0018]有益技术效果：本发明的多肽能够抑制β‑catenin转录活性，下调Wnt/β‑catenin 通路活性，从而应用于和预防肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在肿瘤疾病中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。
附图说明
[0019]图一：将β‑catenin全长质粒、M1及M2分别与HA‑TRIB3质粒共转染进工具细胞293T 中。24小时后收集细胞，免疫共沉淀法结果表明，β‑catenin全长及M2截短与TRIB3有相互作用。
[0020]图二：将β‑catenin M2‑GFP、M3‑GFP、M4‑GFP、M5‑GFP及M6‑GFP质粒共转染进工具细胞293T中。24小时后收集细胞，免疫共沉淀法结果表明，β‑catenin M4截短与TRIB3有相互作用。
[0021]图三：将TRIB3蛋白包被于biacore CM5芯片上，将多肽ARM7以及ARM8按照倍比稀释的方式配制成10μM‑0.3nM 16个不同浓度，分别进样进行检测。结果表明ARM7与TRIB有更强的亲和力。其中，A：ARM7与TRIB3结合的亲和力曲线，KD＝650±120nM，Rmax(RU)＝149.4±23；B：ARM8与TRIB3结合的亲和力曲线，KD＝4±120mM，Rmax(RU)＝35±2.1。
具体实施方式
[0022]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0023]实施例中所述的PBS，指浓度为0.1M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
[0024]实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15～30℃。
[0025]实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。
[0026]实施例1：免疫共沉淀法确认β‑catenin中与TRIB3有相互作用的结构域。[0027]免疫共沉淀试剂如下:
[0028]裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl2·6H2O，0.0742g EDTA，10mL甘油，10mL 10％NP40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。
[0029]裂解液B液：200μL 2Mβ‑磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 8mM NaVO3，2mL 100mM PMSF，200μL 1M DTT，1mg/mL的Leu、Pep及Apr各200μL，总体积共9mL。母液于‑20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。Protein A/G Plus‑Agarose购自美国Santa cruz公司。具体操作步骤如下：
[0030]首先用分子克隆的方法将β‑catenin全长基因进行截短突变，分为M1 1‑140aa及M2 141‑781aa两段，用PCR的方式扩增并构建到带有DDK/MYC标签的PCMV‑6载体当中。然后将β‑catenin全长质粒、M1及M2分别与HA‑TRIB3质粒共转染进工具细胞293T中。24小时后收集细胞，以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4‑10mg，将各组蛋白调整至相同
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