(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010753871.6
(22)申请日 2020.07.30
(71)申请人 中美冠科生物技术（太仓）有限公司
地址 215400 江苏省苏州市太仓市经济开
发区北京西路6号科技创业园
(72)发明人 王书宗 李其翔 李小溪 周军
王飞 周荣云 陈静 黄宇军
(74)专利代理机构 苏州市方略专利代理事务所
(普通合伙) 32267
代理人 朱智杰
(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)
C12N 15/867(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及生物医药技术领域，
具体涉及一种类器官肺癌PDXO模型以及EGFR工程化修饰及
其在肿瘤药物药效学研究中的应用；本发明通过
公开一种类器官肺癌PDXO模型的建立方法，以及
对于此PDXO模型进行EGFR修饰的方法，提供了一
因修饰产生EGFR突变体的工程化肺癌类器官模
型的方法，这些构建出来的类器官模型可以长期
培养或保存，作为肺癌模型，很好地模拟三维肿
瘤的生长特点和微环境，用于临床前药物开发研
究。权利要求书2页 说明书4页 附图1页CN 111876383 A 2020.11.03
C N 111876383
A
1.一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，包括以下制备步骤：
1）Ad-DF+++培养基的预处理；
2）基质胶的预处理；
3）从小鼠上收获的新鲜PDX肿瘤称取约3毫克，用Ad-DF+++冲洗干净，然后切至极小的碎段，用胶原酶 B于37℃消化，并混合；
4）将上述PDX肿瘤消化成单细胞，过滤后收取细胞滤液；
5）离心，80g，8℃，5分钟后收集细胞，然后使用基质胶重悬，最终基质胶浓度为70%；
6）使用滴胶法铺在24孔板中，倒置5分钟后，转入37℃保温箱，倒置保持20-30分钟，然后正置加入传代培养基；
7）传代培养成稳定的类器官肺癌PDXO模型细胞；
8）支原体检测通过支原体检测保证没有支原体污染；
9）通过SNP检测保证此类器官肺癌PDXO模型细胞与母本PDX一致。
2.根据权利要求1所述的一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，所述步骤1，具体为：
将30 毫升Ad-DF+++培养基放入50毫升试管中，并在水浴中加热至37℃。
3.根据权利要求2所述的一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，所述Ad-DF+++含有2 mM Glutamax, 10 mM Hepes, 1x Pen/Strep。
4.根据权利要求1所述的一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，所述基质胶的预处理方法为：放置在冰上。
5.根据权利要求1所述的一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，所述步骤4具体为：将上述PDX肿瘤消化成单细胞，使用20微米滤网过滤，过滤后收取细胞滤液。
6.根据权利要求1所述的一种类器官肺癌PDXO模型，其特征在于，所述步骤6中，传代培养基中包含Noggin 100 ng/ml，B27 1x，n-Acetyl Cysteine 1.25mM，Nicotinamide 5 mM。
7.如权利要求1-6任一项所述的类器官肺癌PDXO模型在肿瘤药物药效学研究中的应用。
8.根据权利要求1-6任一项所述的类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法，包括以下步骤：
a）构建表达质粒；
b)使用293T瞬转并以Western Blot验证质粒表达正确蛋白质；
c)使用第三代慢病毒包装载体在6孔板中培养的293T细胞中包装慢病毒；
d)将肺癌类器官在6孔板中培养备用；
e)在慢病毒包装72小时后收获病毒清液，并使用0.22微米滤芯过滤；
f)使用Dispase将基质胶去除，收获一孔6孔板中的类器官，离心 160x g,8℃, 5 min ，使用Ad+++ 润洗二次；
g)与慢病毒液混合，并加入Polybrene，在室温下保温6小时；
h)离心：160g, 8℃, 5 min ，使用Ad+++ 润洗二次；
i)使用70%最终浓度的基质胶，将病毒感染后的类器官铺板于6孔板；
j)在之后的时间里用显微镜观察GFP+类器官；
k)如果有GFP+类器官生长，使用机械法加胰酶充分消化，至单细胞状态；
l)使用Ad+++重悬，并使用FACS分拣GFP+活细胞；
m)使用96孔板分别收集多克隆和单克隆细胞；
n)多克隆重新铺板于24孔板中，单克隆在96孔板中生长至类器官，然后挑出在1.5毫升管中胰酶消化，离心，润洗，并铺板于24孔板；
o)对于多克隆，铺板密度应该稀疏，待克隆长出单个的类器官体，使用手挑的办法，挑出单克隆类器官，然后在1.5毫升管中胰酶消化，离心，润洗，并铺板于24孔板；
p)单克隆或多克隆长满6孔板后，冻存一部分，另一部分用于鉴定，鉴定包括：Western Blot， FACS，SNP，EGFR mutant测序。
9.根据权利要求8所述的类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法，其特征在于，所述步骤a中的表达质粒为pLVX-EGFR-Del19-T790M-C797S-Zgreen。
10.如权利要求8或9任一项所述的类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法在肿瘤药物药效学研究中的应用。
一种类器官肺癌PDXO模型以及EGFR工程化修饰及其在肿瘤药
物药效学研究中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种类器官肺癌PDXO模型以及EGFR工程化修饰及其在肿瘤药物药效学研究中的应用。
技术背景
[0002]在中国，肺癌的发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤的首位，如2012年中国新发肺癌患者约65.3万，死亡患者约59.7万。其中，非小细胞肺癌患者中最常见的基因突变类型为EGFR基因突变，大约占百分之五十。
[0003]随着肺癌方面的研究进展，已发现对于具有某种基因突变的肺癌患者，靶向与化疗相比会使患者获益更多。
研发抗肿瘤药物在临床前阶段最为重要的一个因素是肿瘤模型。肿瘤模型有细胞模型，PDX模型，CDX模型，类器官模型，动物模型等等。细胞模型简单，但是由于长期传代，会积累不少遗传物质上的突变，从而使得该模型不再忠实于原来的病人来源。动物体内模型以及PDX模型，在模拟肿瘤特质方面不错，但是建立和维持时间和成本上，需要的数额很大。
发明内容
[0004]本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种从PDX开始建立EGFR突变体的肺癌类器官模型的方法和应用。
[0005]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种类器官肺癌PDXO模型，包括以下制备步骤：
1）Ad-DF+++培养基的预处理；
2）基质胶的预处理；
3）从小鼠上收获的新鲜PDX肿瘤称取约3毫克，用Ad-DF+++冲洗干净。然后切至极小的碎段。用胶原酶 B于37℃消化，并混合；
4）将上述PDX肿瘤消化成单细胞，过滤后收取细胞滤液；
5）离心80g, 8℃，5分钟后收集细胞，然后使用基质胶重悬，最终基质胶浓度为70%；
6）使用滴胶法铺在24孔板中，倒置5分钟后，转入37℃保温箱，倒置保持20-30分钟，然后正置加入传
代培养基；
7）传代培养成稳定的类器官肺癌PDXO模型细胞；
8）支原体检测通过支原体检测保证没有支原体污染；
9）通过SNP检测保证此类器官肺癌PDXO模型细胞与母本PDX一致。
[0006]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型，所述步骤1，具体为：将30 毫升Ad-DF++ +培养基放入50毫升试管中，并在水浴中加热至37℃。
[0007]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型，所述Ad-DF+++含有2 mM Glutamax, 10 mM Hepes, 1x Pen/Strep。
[0008]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型，所述步骤2中基质胶的预处理方法为：放置在冰上。
[0009]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型，所述步骤4具体为：将上述PDX肿瘤消化成单细胞，使用20微米滤网过滤，过滤后收取细胞滤液。
[0010]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型，所述步骤6中，传代培养基中包含Noggin 100 ng/ml，B27 1x，n-Acetyl Cysteine 1.25mM，Nicotinamide 5 mM。
[0011]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型在肿瘤药物药效学研究中的应用。[0012]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法，包括以下步骤：a）使用载体质粒pLVX-IRES-ZsGreen1构建表达质粒；
b)使用293T瞬转并以Western Blot验证质粒表达正确蛋白质；
c)使用第三代慢病毒包装载体在6孔板中培养的293T细胞中包装慢病毒；
d)将肺癌类器官在6孔板中培养备用；
e)在慢病毒包装72小时后收获病毒清液，并使用0.22微米滤芯过滤；
f)使用Dispase将基质胶去除，收获一孔6孔板中的类器官。离心 160g,8℃, 5 min ，使用Ad+++ 润洗二次；
g)与慢病毒液混合，并加入Polybrene。在室温下保温6小时；
h)离心：160g, 8℃, 5 min ，使用Ad+++ 润洗二次；
i)使用70%最终浓度的基质胶，将病毒感染后的类器官铺板于6孔板；
j)在之后的时间里用显微镜观察GFP+类器官；
k)如果有GFP+类器官生长，使用机械法加胰酶充分消化，至单细胞状态；
l)使用Ad+++重悬，并使用FACS分拣GFP+活细胞；
m)使用96孔板分别收集多克隆和单克隆细胞；
n)多克隆重新铺板于24孔板中。单克隆在96孔板中生长至类器官，然后挑出在1.5毫升管中胰酶消化，离心，润洗，并铺板于24孔板；
o)对于多克隆，铺板密度应该稀疏，待克隆长出单个的类器官体，使用手挑的办法，挑出单克隆类器官，然后在1.5毫升管中胰酶消化，离心，润洗，并铺板于24孔板；
p)单克隆或多克隆长满6孔板后，冻存一部分，另一部分用于鉴定。鉴定包括：Western Blot， FACS，SNP，EGFR mutant测序。
[0013]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法，所述步骤a中的表达质粒为pLVX-EGFR-Del19-T790M-C797S-Zgreen。
[0014]进一步的，上述一种类器官肺癌PDXO模型的EGFR修饰方法在肿瘤药物药效学研究中的应用。
[0015]本发明有如下有益效果：
1）本发明从PDX模型出发建立相应的肺癌类器官模型，并使用EGFR突变体慢病毒感染法工程化修饰使其成为相应突变体的肺癌类器官模型。
[0016]2）本发明所述建立方法利用肺癌PDX模型产生的肿瘤，经过酶处理得到接近于单细胞得培养物，其中的上皮干细胞继续在体外特定的培养条件下，可以无限地生长下去，并长成有序三维结构的肺癌类器官模型。
[0017]3）本发明在此基础上继续使用慢病毒方法将其工程化修饰，表达特定的EGFR突变
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议