(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010252609.3
(22)申请日 2020.04.02
(71)申请人 南通大学
地址 226019 江苏省南通市崇川区啬园路9
号
(72)发明人 于彬 王东 刘明稳 顾晓松
(74)专利代理机构 北京科家知识产权代理事务
所(普通合伙) 11427
代理人 徐思波
(51)Int.Cl.
A61K 45/00(2006.01)
A61P 25/00(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损
伤修复方面的应用
(57)摘要
本发明公开一种m6A修饰相关基因ALKBH5在
制备神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。
本发明还公开一种实验性验证m6A修饰相关基因
ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其
特征在于，包括以下步骤：S1、检测ALKBH5的表达
及定位；S2、干扰ALKBH5的表达对神经元轴突生
长的影响；S3、干扰ALKBH5的表达对坐骨神经轴
突生长的影响；S4、ALKBH5靶基因LPIN2的筛选及
功能检测的过程。本发明验证了体内外干扰
ALKBH5基因均能显著促进神经元轴突的生长，促
进坐骨神经功能的恢复；并通过ALKBH5干扰后的
转录组分析及靶基因验证，寻ALKBH5调控的靶
基因LPIN2，验证在调控神经元轴突生长中的作
用。权利要求书4页 说明书8页 附图2页CN 111330009 A 2020.06.26
C N 111330009
A
1.一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备周围神经损伤的药物中的应用，其特征在于，所述神经轴突损伤相关疾病包括周围及中枢神经损伤。
3.一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、检测 ALKBH5的表达及定位：制备大鼠坐骨神经损伤模型，通过 Western blot 检测坐骨神经损伤的大鼠模型中DRG组织中 ALKBH5的表达变化；通过免疫荧光检测坐骨神经损伤的大鼠模型在术后不同时间点内DRG中ALKBH5表达并定位；
S2、干扰 ALKBH5的表达对神经元轴突生长的影响：分离培养DRG神经元；通过注射AAV 病毒，使DRG神经元病毒感染，干扰ALKBH5的表达；体外神经元轴突生长实验检测干扰ALKBH5对神经元轴突生长的影响；
S3、干扰 ALKBH5的表达对坐骨神经轴突生长的影响：选择实验用动物SD大鼠，鞘内注射干扰病毒；鞘内注射2周后再进行坐骨神经夹伤；对坐骨神经夹伤的大鼠进行灌流和脱水；坐骨神经轴突染实验检测体内干扰ALKBH5对坐骨神经轴突生长的影响； S4、ALKBH5靶基因LPIN2的筛选及功能检测：筛选ALKBH5靶基因LPIN2；分离培养DRG神经元；DRG神经元中LPIN2干扰RNA的转染；体外神经元轴突生长实验，干扰ALKBH5靶基因LPIN2，检测对神经元轴突生长的影响。
4.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S1中，大鼠坐骨神经夹伤模型的制备过程如下：选取实验用SD大鼠，每批15只，成年雄鼠，体重180-220g；将大鼠分成3组，每组5只；手术前，首先对大鼠进行腹腔麻醉，再将左侧后肢被毛消毒；用手术剪暴露皮肤，再用眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的肌肉与基膜，使用夹伤钳夹住坐骨神经近端，夹伤处3mm宽，夹伤持续30s，夹伤结束后将坐骨神经收回肌肉下，最后将伤口缝合；术后的鼠注意保暖，并对其注射1ml生理盐水加速麻药代谢出体外；夹伤3d后，在夹伤缝合处涂
抹碘伏后用手术剪剪开皮肤，换眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的基膜与肌肉，暴露出坐骨神经后到夹伤位置，以夹伤位置为标记，收取坐骨神经组织置于甲醛溶液中。 5.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S1中DRG样本蛋白质提取、Western blot检测及免疫荧光检测，具体还包括以下过程：
DRG样本蛋白质提取及Western blot检测：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h，1d及3d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，通过组织样本蛋白质提取试剂盒进行组织蛋白样本制备；将不同时间点的L4、L5 DRG组织用吸头从冻存管中转移至1.5 ml EP 管中；向管中加入150ul组织裂解液，使用匀浆器将组织打成单细胞悬液后置于冰上裂解15min后，离心10min；取出离心管，吸取上清至新EP管中，检测样本中的蛋白浓度，测定并记录蛋白质样品的浓度，吸取一部分样品进行蛋白质变性，剩余样本做好标记储存在-80℃中；根据所测样本的蛋白质浓度，加入适量的6Xloading蛋白质上样缓冲液，混匀后95℃变性10min；制备聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳，120V 100min，转膜100v 40min，用5%脱脂乳封闭室温2h，4℃孵育一抗ALKBH5，GAPDH过夜后，二抗Rabbit-HRP室温孵育2h，用ECL进行显影； 免疫荧光检测：DRG中ALKBH5的免疫荧光检测：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h及3d坐骨神
经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，经4%PFA固定后制作冰冻切片；FISH 检测首先对切片样本进行0.3%TBST室温清洗2次，10min/次，室温封闭1h后4℃孵育一抗ALKBH5，Neun 过夜后，荧光二抗Rabbit-488及Mouse-594室温避光孵育2h，荧光显微镜观察摄片。
6.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，所述步骤S2和步骤S4中，分离培养DRG神经元，具体包括以下过程：准备解剖液放入小皿中，加入双抗后置于冰上预冷；腹腔麻醉3只大鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中；弃去解剖液，用PBS淋洗组织2遍；弃去PBS，加入2ml胶原酶，将组织及消化液转移至5ml离心管中；用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min；离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用吹打1min至组织分散均匀，放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱；待组织消化至无明显组织块，向离心管中加入3ml消化终止液终止消化；用吹打1min，过筛网，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中离心弃去上清；向离心管中加入4ml提前预热的BSA溶液，重悬细胞，9000rpm离心5min，吸弃漂浮的杂细胞；再重复一遍此过程；加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到6孔板中，十字混匀细胞后放入5% CO2，37℃培养箱中。
7.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S2中，DRG神经元病毒感染，包括以下过程：观察细胞贴壁情况良好后，在
细胞接种24h内，加入AVV病毒，病毒感染量控制在2×/ cell；病毒加入24h内将感染培养基弃去，换成新鲜完全培养基；病毒感染96h后，观察到细胞表达GFP荧光较强时收取细胞。
8.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S2和步骤S4中，体外神经元轴突生长实验，具体包括以下步骤：
染前对细胞进行病毒预感染96h，观察病毒表达GFP荧光亮度较亮即可进行染；弃去细胞培养基，加入预热后的1×PBS润洗细胞；
弃去1×PBS，加入预冷的4%多聚甲醛，冰上固定20min；弃去甲醛后，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；
清洗结束后弃去PBS，滴加封闭液，每孔200μl，室温静置40min；
弃去封闭液，轻轻滴加用一抗稀释液稀释Anti-β-Tublin Ⅲ antibody，每孔200μl，4℃ 静置孵育过夜；
弃去一抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；
弃去PBS，轻轻滴加用二抗稀释液稀释的Alexa fluor 647 goat anti-rabbit，每孔200μl，室温静置孵育2h；
弃去二抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；
清洗结束后，将圆玻片挑出孔，将有细胞一面朝下覆盖在滴有封片液的载玻片上，置于湿盒中存放在4℃中。
9.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损
伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S3中，干扰病毒鞘内注射、组织灌流与脱水及坐骨神经免疫化学染，具体包括以下过程：
干扰病毒鞘内注射：选取实验用SD大鼠，每批15只，成年雄鼠；将实验鼠随机分成3组，每组5只；术前，首先对大鼠进行腹腔麻醉，再将大鼠背部髂骨附近进行消毒，接着用手术剪暴露皮肤，用眼科剪沿着髂骨切开肌肉组织，换骨剪剪除突起的棘突，再用沾有生理盐水的小棉球轻轻擦拭掉血和碎肉，清晰暴露出L4、L5 DRG的椎间孔，将包装了shRNA的2/8型AAV 病毒用微量进样器匀速注入椎间孔中；在注射完成后将鼠平放2min后再缝合伤口；在鞘内注射2周后，对注射病毒的大鼠进行坐骨神经夹伤；
组织灌流与脱水：现配4%甲醛溶液置于冰上预冷待用；首先、对大鼠进行腹腔麻醉，将大鼠固定好后用手术剪向心脏方向剪开腹部皮肤，暴露出横膈膜后沿边缘剪开即可暴露心脏，剥开盖在心脏上的脂肪组织暴露出动脉，将针管从心尖位置插入伸至动脉中，开启生理盐水灌流再用眼科剪剪开右心耳，待大鼠
体内所有血液被生理盐水置换出来后打开甲醛灌流，观察到大鼠四肢均僵硬后可进行取材操作；取出的组织浸泡在4%甲醛溶液中，8h后弃去甲醛溶液，用1×PBS清洗掉残留的甲醛，最后换成30%蔗糖溶液进行组织脱水；观察组织在蔗糖溶液中下沉即视为脱水完成，将组织取出置于解剖镜下，用显微镊修剪除去多余肌肉组织，然后，捋直放置在附有蔗糖溶液的冻台上，再加入蔗糖溶液进行速冻，冻台制作好之后存放在-20℃待切片处理；切片前准备用PLL包被好的载玻片，按实验所需设定好切片的厚度后即可开始切片；切片完成后置于50 ℃烘箱中烘干2h，烘干后密封好可储存在-80 ℃中；
坐骨神经免疫化学染：染前1h将组织切片从-80 ℃中取出，放置室温中复温1h；选取无皱褶，形态完整，不含气泡的组织放入盛有1×PBS的洗槽中，置于摇床上低速清洗15min；从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍后用组化笔圈隔组织，在圈中加入适量免疫染封闭液，置于湿盒中室温静置1h；加封闭液前尽量保持组织湿润否则影响染效果；弃去封闭液，擦拭掉组织边的水渍，在组化圈内滴加用一抗稀释液稀释的SCG10-，置于湿盒中4℃静置过夜；第二天，将湿盒置于室温静置1h；弃去一抗，将切片置于盛有1×PBS的洗槽中，于摇床上低速清洗3次，15min/次；从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍，避光条件下，在组化圈内滴加用二抗稀释液稀释的Alexa fluor 647 goat anti-rabbit，置于避光湿盒中室温孵育2h；弃去二抗，将切片置于盛有1×PBS的洗槽中，于摇床上低速清洗3次，15min/次；避光条件下，从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍，在组化圈内滴加荧光封片液，用盖玻片封片后存放于湿盒中。
10.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S4中，靶基因的筛选及DRG神经元中LPIN2干扰RNA的转染，具体包括以下过程：
靶基因的筛选：对干扰ALKBH5 表达的DRG神经元及对照组进行提取总RNA，进行转录组测序；对差异表达基因进行GO pathway分析，筛选出与轴突生长有关的基因得到10个基因；对干扰ALKBH5的DRG神经元进行qRT-PCR验证，发现有5个基因表达明显降低：ALDH3B1、GALNS、LPIN2、COX8A及ST6GA1；
DRG神经元中LPIN2干扰RNA的转染：DRG神经元分离后接种到细胞培养板后，即可进行干扰RNA的转染；在离心管A中将1ul的转染试剂加入到25ul的转染培养基中轻轻混匀，同时
准备另一个离心管B，加入2.5ul的干扰RNA到25ul的转染培养基中轻轻混匀，将离心管A中的液体缓缓加入离心管B中，轻轻混匀，静止15min后，均匀加入预先接种DRG神经元的细胞培养板中十字混匀细胞后放入5% CO2，37℃培养箱中；转染48h后收取细胞。
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