(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202010749351.8
(22)申请日 2020.07.30
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 112521398 A
(43)申请公布日 2021.03.19
(73)专利权人 上海交通大学医学院附属仁济医
院
地址 200001 上海市黄浦区山东中路145号
(72)发明人 林厚文 焦桴荣 顾斌斌
(74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280
代理人 赵青 余志强
(51)Int.Cl.
C07D 493/20(2006.01)
A61P 29/00(2006.01)
C12P 17/18(2006.01)
C12R 1/66(2006.01)(56)对比文件CN 109704945 A ,2019.05.03CN 109761948 A ,2019.05.17CN 101519438 A ,2009.09.02CN 106866776 A ,2017.06.20审查员 王江维 (54)发明名称
物及其制备方法与应用
(57)摘要
本发明涉及医药技术领域，
asperfloketals A和B，
其化学结构式如下：本发明还公开了制备asperfloketals A和B的方法。本发明化合物asperfloketals A和B对多种肿瘤细胞株及其各自正常细胞株无细胞毒性，但能够在CuSO 4诱导的斑马鱼抗炎活性模型中表现出优于阳性对照药的抗炎活性。这两个化合物可 用于抗炎类药物的开发。权利要求书1页 说明书8页 附图5页CN 112521398 B 2022.03.15
C N 112521398
B
1.一种海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物，其特征在于，其为下列结构的化合物A
或B，
2.如权利要求1所述的海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物的制备方法，其特征在于，其包括步骤：以海绵共附生菌的发酵物作为原料，通过提取和分离得到目标化合物； 所述海绵共附生菌为棕扁海绵Pha kellia f usca 共附生真菌As pe rg illus flocculosus 16D ‑1；所述的发酵物通过以下步骤制得：使用大米培养基，采用固体静置发酵的方式，对海绵共附生菌进行发酵得到发酵物；
海绵共附生菌的发酵物采用甲醇冷浸提取，提取液浓缩得到浸膏后再进行分离；
提取液浓缩得到浸膏后用水混悬，再用乙酸乙酯萃取浓缩后依次经谱分离得到目标化合物；
所述的谱分离依次包括：
减压硅胶柱谱分离，采用二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，合并含有甾体类化合物的馏分；反相中压ODS柱谱分离，采用甲醇‑水系统梯度洗脱，获得含有甾体类化合物的精细馏分；
高效液相谱法分离，采用50～65％甲醇水洗脱，得到目标化合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反相中压ODS柱谱分离时，采用的甲醇‑水系统梯度为10:90～100:0。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，高效液相谱法分离时，流速3.0mL/min，检测波长210nm和254nm。
5.如权利要求1所述的海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物在制备抗炎药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗炎药物是指直接用于预防、和研究炎症及其相关疾病的药物。
权 利 要 求 书1/1页CN 112521398 B
一种海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物及其制备方法与
应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物及其制备方法与应用。
技术背景
[0002]真菌次生代谢产物(FSMs)是制药工业中最具吸引力的天然产物来源之一。它们独特的结构和潜在的生物活性激发了化学家、药理学家和生物学家的灵感，并刺激了新药的开发【(1)Rodrigues,T.；Reker,D.；Schneider,P.；Schneider,G.Counting on natural products for drug design.Nat.Chem,2016,8,531‑541.(2)Du,L.；Robles,A.J.；King, J.B.；Powell,D.R.；Miller,A.N.；Mooberry,S.L.；Cichewicz,R.H.Crowdsourcing Natural Products Discovery to Access Uncharted Dimensions of Fungal Metabolite Diversity.Angew.Chem.Int.Ed,2014,53,804–809.】。近年来，具有抗炎活性的海洋来源天然小分子化合物被不断报道，从海洋天然产物中挖掘新型抗炎小分子药物越来越受到各国科学家的重视【(3)Cheung,R.C.F.；Ng,T.B.；Wong,J.H.；Chen,Y.C.；Chan, W.Y.Marine natural products with anti‑inflammatory activity.Appl.Microbiol.B iotechnol.2016,100,1645–1666.】。而在现今的临床过程中，传统糖皮质激素类甾体抗炎药(steroidal anti‑inflammatory drugs,SAIDs)和非甾体抗炎药(non‑steroidal anti‑inflammatory drugs,NSAIDs)占据小分子抗炎药物的主导地位，虽然作用机制明确，但长期使用多有耐药性和不良反应【(4)Ptaschinski,C.；Lukacs,N.W.Chapter 2–Acute and chronic inflammation induces disease pathogenesis.Molecular Pathology(2nd Edition).2018,25–43.】。临床迫切需求具有优良安全性的新型小分子抗炎药物。[0003]真菌Aspergillus flocculosus 16D‑1为棕扁海绵(Phakellia fusca)共附生真菌，其中甾体类化合物是该真菌中一类重要的代谢产物。甾体类
化合物由于其易多变的骨架重排和丰富多样的生物活性，引起国内外广大学者的广泛研究。这些甾体类化合物的主要活性包括抗肿瘤、抗炎、抗感染、免疫抑制等多种药理活性【(5)Duecker,F.L.；Reuβ, F.；Heretsch,P.Rearranged ergostane‑type natural products:chemistry,biology, and medicinal aspects.Org.Biomol.Chem.2019,17,1624–1633.(6)Chen,L.X.；He,H.；Qiu,F.Natural withanolides:an overview.Nat.Prod.Rep.2011,28,705–740.(7)Dhar, N.；Razdan,S.；Rana,S.；Bhat,W.W.；Vishwakarma,R.；Lattoo,S.K.A decade of molecular understanding of withanolide biosynthesis and in vitro studies in Withania somnifera(L.)Dunal:prospects and perspectives for pathway engineeri ng.Front.Plant.Sci.2015,6,1031.(8)Gu,B.B.；Wu,W.；Jiao,F.R.；Jiao,W.H.；Li,L.；Sun,F.；Wang,S.‑P.；Yang,F.；Lin,H.W.Aspersecosteroids A and B,Two 11(9→10)‑abeo‑5,10‑Secosteroids with a Dioxatetraheterocyclic Ring System from Aspergillus flocculosus 16D‑1.Org.Lett.2018,20,7957–7960.(9)Gu,B.B.；Wu,W.；
Jiao,F.R.；Jiao,W.H.；Li,L.；Sun,F.；Wang,S.P.；Yang,F.；Lin,H.W.Asperflotone,an 8 (14→15)‑abeo‑ergostane from the sponge‑derived fungus Aspergillus flocculosus 16D‑1.J.Org.Chem.2018,84,300–306.】。该类型化合物广泛的生物活性和多变的结构引起了化学家和生物学家的持续关注。
发明内容
[0004]本发明的第一目的在于公开一种海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物，其为下列结构的化合物A或B，
[0005]
[0006]化合物A和B为新骨架甾体类化合物，分别命名为asperfloketals A和B。[0007]本发明的第二目的在于公开所述海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物的制备方法。本发明以海绵共附生菌的发酵物为原料，通过提取和分离得到目标化合物asperfloketals A和B。
[0008]较佳的，所述海绵共附生菌为棕扁海绵(Phakellia fusca)共附生真菌Aspergillus flocculosus 16D‑1。
[0009]较佳的，所述的发酵物通过以下步骤制得：采用固体静置发酵的方式，对海绵共附生菌进行发酵得到发酵物。
[0010]较佳的，海绵共附生菌采用大米作为培养基进行发酵。
[0011]较佳的，海绵共附生菌的发酵物采用甲醇冷浸提取，提取液浓缩得到浸膏后再进行分离。
[0012]较佳的，海绵共附生菌的发酵物先用甲醇浸泡捣碎后进行合并提取。
[0013]较佳的，提取液浓缩得到浸膏后用水混悬，再用乙酸乙酯萃取浓缩后依次经谱分离得到目标化合物。
[0014]较佳的，所述的谱分离包括减压硅胶柱谱分离、反相中压ODS柱谱分离和高效液相谱法分离。
[0015]较佳的，所述的谱分离依次包括：
[0016]减压硅胶柱谱分离，采用二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，合并含有甾体类化合物的馏分；
[0017]反相中压ODS柱谱分离，采用甲醇‑水系统梯度洗脱，获得含有甾体类化合物的精细馏分；
[0018]高效液相谱法分离，高效液相谱法分离，采用50～65％甲醇水洗脱，得到目标
化合物。
[0019]较佳的，反相中压ODS柱谱分离时，采用的甲醇‑水系统梯度为10:90～100:0。[0020]较佳的，高效液相谱法分离时，流速3.0mL/min，检测波长210nm和254nm。[0021]较佳的，采用53～57％优选55％甲醇水洗脱，得到化合物asperfloketal A；或者采用58～62％优选60％甲醇水洗脱，得到化合物asperfloketal B。
[0022]本发明的第三目的在于公开所述的海绵共附生菌来源开环重排甾体化合物的应用，尤其是在制备抗炎药物中的应用。
[0023]所述的抗炎药物包括但不限于直接用于预防、诊断、检测、保护、和研究炎症及其相关疾病的药物。
[0024]活性试验证明，本发明化合物asperfloketals A和B在体外对3种人源肿瘤细胞均
诱导的斑马鱼抗炎活性模型无有细胞毒性，asperfloketal A和asperfloketal B在CuSO
4
中表现出优于阳性对照药的抗炎活性，因此可用于制备抗炎药物的开发。
[0025]本发明的有益效果在于：
[0026]本发明自海绵共附生菌的发酵物中提取得到开环重排甾体化合物asperfloketals A和B，制备方法简单，通过该方法制备得到的化合物asperfloketals A和诱导的斑马鱼抗炎活性模型中表现出很强的抑制活性，同时对多种人源肿瘤细胞B在CuSO
4
其各自正常细胞株均无细胞毒性；本发明为研究和开发新的抗炎药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。
附图说明
[0027]图1为本发明化合物asperfloketals A和B的二维核磁数据关键相关示意图；[0028]图2为本发明化合物asperfloketals A的实测ECD谱和计算ECD谱的比对；[0029]图3为本发明化合物asperfloketals B的实测ECD谱和计算ECD谱的比对；[0030]图4为本发明化合物asperfloketals A的实测碳谱数据和计算碳谱数据的相关图；
[0031]图5为本发明化合物asperfloketals B的实测碳谱数据和计算碳谱数据的相关图；
[0032]图6为本发明化合物asperfloketals A和B的Mosher法构型关系示意图(Δδ＝δ
‑
S ,(S)‑和(R)‑MPTAesters(1a/2a和1b/2b))；
δ
R
[0033]图7为本发明化合物在转基因斑马鱼Tg(JS7)胚胎模型中的抗炎活性(n＝3)。(a)斑马鱼幼苗躯干侧面观察显示出加入不同asperfloketals A和B经过CuSO
刺激2小时后神
4
经丘周围巨噬细胞迁移的变化图；采用布洛芬(lbuprofen)作为阳性对照药；白箭头标示迁移的巨噬细胞。(b)斑马鱼模型中添加化合物asperfloketals A和B后巨噬细胞迁移的定量分析。数据来源于3次单独
实验，用标准偏差来表示±SD，**p<0.05，##p<0.01与对照组比较。
具体实施方式
[0034]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
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