(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711178452.9
(22)申请日 2017.11.23
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2015814 2015.12.31
(71)申请人 青岛农业大学
地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路
700号
(72)发明人 王彩霞 孟璐璐 李桂舫 张清明
李保华
(74)专利代理机构 北京汇捷知识产权代理事务
所(普通合伙) 11531
代理人 李宏伟
(51)Int.Cl.
C12N 1/16(2006.01)
A01N 63/04(2006.01)
A01P 3/00(2006.01)C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称
一种季也蒙毕赤酵母及其应用
(57)摘要
属于植物病害生物防治技术领域。该菌株为季也蒙毕赤
酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1，菌种保
藏号为CCTCC NO:M2015814。利用上述的季也蒙
毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1制
备用于防治葡萄病害的生防制剂，对多种致病真
菌具有显著的防治效果。本发明所提供的生防制
剂活性成分季也蒙毕赤酵母(M e y e r o z y m a
guilliermondii)Y-1具有防治效果稳定，持效性
长和防病谱广特性，且环保安全，不宜产生抗药
性；菌株繁殖速度快，培养条件简单，易于保存和
工业生产；还能提高植物体内防御相关酶活性，
具有良好的开发和应用前景。权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图3页CN 107937284 A 2018.04.20
C N 107937284
A
1.一种防治苹果果实轮纹病的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1，于2015年12月31日保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2015814。
2.一种利用权利要求1所述的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1制备的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于用于防治葡萄病害。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1用于增强植物体内防御酶的活性，所述的防御酶为CAT、PPO、SOD和POD。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：使用时将季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1制备成菌悬液。
6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1菌悬液通过喷施或浸润的方式施用于葡萄。
7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y -1菌悬液浓度为103～108cfu ·mL -1，最优浓度为107cfu ·mL -1。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述葡萄病害为由病原真菌引起的苹果白腐病、灰霉病、青霉病、褐腐病和病。
9.根据权利要求3和8所述的应用，其特征在于：所述葡萄白腐病病原菌为白腐垫壳孢(Coniella diplodiella)、灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、青霉病病原菌青霉菌(Penicillium spp)、褐腐病病原菌链核盘菌(Monilinia spp)和病病原菌为胶孢菌(Colletotrichum gloeosporioides)。 10.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于所述生防菌剂的制备方法如下：
1)培养基的制备：
酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基：酵母提取物(Yeast Extract)10g，蛋白胨(Peptone)20g，溶解于900mL水中，加入20g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入100mL 已灭菌的20％葡萄糖溶液；
酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，溶解于900mL水中，121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入100mL已灭菌的20％葡萄糖溶液。分装于250mL三角瓶中，装液量为80mL；
2)季也蒙毕赤酵母Y -1菌株的活化：将菌株按无菌操作要求划线接种于YPD琼脂培养基中，30℃恒温培养2-3d；
3)季也蒙毕赤酵母Y -1菌株的液体培养：挑取步骤2)中活化的Y -1菌株的单菌落，接种于瓶装量为80mL/250mL的YPD液体培养基中，150r ·min -1，30℃恒温震荡培养24h，得到菌株Y -1发酵种子液。将所述发酵种子液按1:100的接种量接种到所述的YPD液体培养基中，30℃恒温震荡培养48h，得到浓度为107cfu ·mL -1的季也蒙毕赤酵母Y -1菌株的细胞培养液；
4)季也蒙毕赤酵母Y -1生防制剂的制备：将步骤3)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，6000r ·min -1离心10min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到108cfu ·mL -1的菌悬液；
5)稀释：将步骤4)中制备的108cfu ·mL -1的菌悬液稀释0-100倍；步骤3)中所述的细胞培养液和4)中所述的菌悬液均为生防制剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 107937284 A
一种季也蒙毕赤酵母及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别涉及一种季也蒙毕赤酵母Y-1及其在防治葡萄真菌病害中的应用。
背景技术
[0002]葡萄是一种艳味美且营养丰富的水果，是人们重要的营养来源和物质基础。我国葡萄栽培面积和产量均位居世界前列，其中山东葡萄产量约占全国总产量的16％。我国葡萄生产以鲜食品种和酿酒品种为主，产量占世界葡萄总量的35％，世界排名第二。然而，葡萄病害严重制约着葡萄产业的健康可持续发展，葡萄生产及采后各环节因真菌感染而造成的病害给葡萄产业带来了巨大的经济损伤。有效防治葡萄病害，对提高葡萄品种、产量一级稳定葡萄酿酒工业具有重要意义。
[0003]危害严重的葡萄病害主要包括葡萄白腐病(Coniella diplodiella)、灰霉病(Botrytis cinerea)、青霉病(Penicillium sp.)、褐腐病(Monilinia sp.)和病(Colletotrichum gloeosporioides)等。生产上防治上述病害多采用套袋保护、避雨栽培、化学药剂防治等措施，但是套袋保护和避雨栽培措施不仅增加了生产成本，而且改变了微生态环境，加重了灰霉病、黑点病和白粉病等病害的发生，也增加了很多害虫的防治难度。目前，葡萄病害的防控措施主要还是依靠喷洒化学药剂，但是化学杀菌剂的药剂残留、病原菌易对其产生抗性和环境污染严重等问题已日趋严重。因此，寻求可替代化学杀菌剂的安全有效防治措施
已成为葡萄病害和采后贮藏病害防治中亟待解决的问题。
[0004]大量研究表明，生物防治因其高效和无污染的特点，是解决农业可持续发展的有效途径，有的生防制剂已在生产中得到应用。酵母因其具有生长繁殖能力强、遗传稳定、广谱抗菌、与化学杀菌剂兼容，且不产生有毒物质，对人体没有危害，对生长环境要求不苟刻等优点，而成为生防微生物中最最受关注的生防菌。以有效生防微生物取代化学杀菌剂，用于葡萄病害的防治已显示出巨大的应用前景。
发明内容
[0005]本发明针对目前农业生产中葡萄生产和储藏期主要真菌病害防治难度大，成本高，化学农药抗性日益突出，农药残留高等问题，筛选出一株高效生防菌株并制备生防制剂，对葡萄真菌病害进行有效防治。以此减少化学药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟葡萄病害病原菌抗、耐药菌株的出现，以实现葡萄产业向着安全、高效、可持续的方向发展。
[0006]为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007]本发明从葡萄果实表面分离、筛选获得一株用于葡萄真菌病害生物防治的酵母菌株Y-1，经形态学观察、生理生化特性及ITS序列分析鉴定为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)，该菌株已于2015年12月31日保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号： CCTCC NO:M2015814，经检验存活。
[0008]利用上述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1制备用于防治葡萄真菌病害的生防制剂。
[0009]在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1用于增强植物体内防御酶的活性，所述的防御酶为CAT、PPO、SOD和POD。
[0010]在上述方案的基础上，使用时将季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii) Y-1制备成菌悬液。
[0011]在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1菌悬液通过喷施或浸润的方式施用于葡萄。
[0012]在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1菌悬液浓度为103～108cfu·mL-1，最优浓度为 107cfu·mL-1。
[0013]在上述方案的基础上，所述葡萄病害为由病原真菌引起的葡萄白腐病、灰霉病、青霉病、褐腐病和病。
[0014]在上述方案的基础上，所述葡萄白腐病病原菌白腐垫壳孢 (C o n i e l l a diplodiella)、灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、青霉病病原菌青霉菌(Penicilliumspp.)、褐腐病病原菌链核盘菌(Monilinia spp)和病病原菌为胶孢菌 (Colletotrichum gloeosporioides)。
[0015]本发明有益效果：
[0016]与现有技术相比，本发明的优点是：1)所述季也蒙毕赤酵母 (Meyerozyma guilliermondii)Y-1从葡萄果实表面分离获得，对真菌引起的葡萄病害如葡萄白腐病、灰霉病、青霉病、褐腐病和病等均具有显著的防治效果；2)所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1具有持效期长和广谱特性，菌株Y-1菌体除对上述葡萄病害病原菌有抑制作用外，还对苹果轮纹病菌 (Botryosphaeria dothidea)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果果实斑点病病原菌菌核生枝顶孢菌(Acremoniumsclerotigenum)、霉心病病原菌粉红单端孢菌(Trichothecium roseum)、链格孢菌 (Alterna ria alternate)和镰刀菌(Fusarium spp.)等具有显著拮抗作用；经菌株Y-1菌悬液处理过的葡萄果实，贮藏30d后，防腐效果仍在80％以上；3)季也蒙毕赤酵母(M e y e r o z y m a guilliermondii) Y-1本身不产生有毒物质，环保安全，不宜使病原菌产生抗药性；4) 酵母菌株Y-1繁殖速度快，发酵条件简便，使用方法简单，成本低； 5)防治上述葡萄果实病害效果显著，最高防治效果可达87％，6) 使用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii) Y-1还能提高葡萄果实内防御酶CAT、PPO、SOD和POD的活性，使果实抗病能力显著提高。
附图说明
[0017]图1所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)Y-1在 YPD琼脂培养基上的菌落形态；
[0018]图2季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1提取 DNA的ITS序列PCR扩增示意图；
[0019]图中M为核酸Marker DL2000；1-8均为菌株Y-1基因组DNA 的ITS序列扩增结果；[0020]图3季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用；
[0021]图中A为葡萄灰霉病菌在不添加菌株Y-1的PDA上培养3d的菌落；图中B-F为葡萄灰霉病菌在添加菌株Y-1菌体浓度分别为103，104，105，106和107cfu·mL-1的PDA上培养3d的菌落；
[0022]图4季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1对葡萄病菌菌丝生长的抑制作用；
[0023]图中A为葡萄病菌在不添加菌株Y-1的PDA上培养3d的菌落；图中B-F为葡萄病菌在添加菌株Y-1菌体浓度分别为103，104，105，106和107cfu·mL-1的PDA上培养3d的菌落；
[0024]图5季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1显著提高葡萄果实内防御酶活性；
[0025]图6季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y-1不同浓度菌悬液对苹果轮纹病的防治效果；
[0026]图中A为接种PDA培养基再接种轮纹病菌的对照；图中B，C 和D分别为Y-1菌悬液106cfu·mL-1，107cfu·mL-1和108cfu·mL-1对苹果轮纹病的防治效果。
具体实施方式
[0027]以下实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]实施例1所述季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)Y-1的分离与菌株鉴定
[0029] 1.1菌株的分离与筛选
[0030]从山东烟台商品化葡萄园采集成熟健康巨峰葡萄，从葡萄表面分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离法，用PDA培养基(含有硫酸链霉素)和YPD琼脂培养基(含有硫酸链霉素)分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异明显的菌落，在YPD琼脂培养基上纯化保存，并以葡萄白腐病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株活性强的拮抗酵母菌菌株，命名为Y-1。
[0031]上述所用PDA培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取 200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，pH值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0032] 1.2菌株的鉴定
[0033](1)形态特征：菌株Y-1在YPD琼脂培养基上培养24h后，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜都很均一，菌落多为乳白，但比细菌菌落稍大且厚，
如图1所示。
[0034](2)生理生化特性：菌株Y-1在YPD液体培养基中，28℃振荡培养基2d，原来透明的培养基逐渐变浑浊，溶液呈淡黄。菌株Y-1 可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用乳糖和甘露醇，可水解淀粉，发酵需要氧气。
[0035](3)DNA的ITS序列分析：采用酵母基因组DNA提取试剂盒(生工)提取酵母基因组DN A，采用通用引物Prim e r F：5’-TC CG T AGG TG AACCTG CGG-3’，Prim e r R：5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’对DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增反应体系(25μL)：2.5μL 10×
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