(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811158350.5
(22)申请日 2018.09.30
地址 200335 上海市闵行区北翟路2901号
(72)发明人 刘毅 刘国兰 张安宁 王飞名
毕俊国 孔德艳 余新桥 罗利军
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 周倜
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记及其方法和应用(57)摘要本发明公开了水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记及其应用，通过将低柱头外露率品种沪旱1B与高柱头外露率率品种II -32B杂交，回交，及自交获得BC3F2及BC3F3，并对各后代株系进行柱头外露率表型调查及遗传连锁分析，将品种II -32B的柱头外露率基因qSE7精细定位于第7染体分子标记RM3859和Indel4373之间的28.5k 区间，与该基因连锁的分子标记是Indel4373，Indel4380，Indel4385，Indel4419，Indel4459，Indel4477，RM5436之一。本发明分子标记可以有效检测高柱头外露率品种II -32B及其衍生品系中是否含有qSE7基因位点，从而快速导入控制柱头外露率的QTL，提高选择效率，为杂交水稻不育系柱头外露率的提高和制种产量的提高提供帮 助。权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 109207621 A 2019.01.15
C N 109207621
A
1.水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记，其特征在于：由下述之一的引物对经PCR扩增获得：
1）标记引物，RM3859
左端引物序列，TTGCAGATCGGTTTCCACTG
右端引物序列，GGTCCTGGATTCATGGTGTC；
2）标记引物，Indel4373
左端引物序列，AGTCTTTGATGGAAAGCTCC
右端引物序列，TATTCCCAAAATTTTCATGG；
3）标记引物，Indel4380
左端引物序列，AGGATCAGCTGAGAGACAAG
右端引物序列，ACGTCGCAGAAGATGATG；
4）标记引物，Indel4385
左端引物序列，TCAAGGACTAATTTGCAGAA
右端引物序列，AAGATGGCACTTTACTCAAT；
5）标记引物，Indel4419
左端引物序列，TCGCATTTGTGAATTAGTTG
右端引物序列，AGCATAGCTCTGAAAACAGG；
6）标记引物，Indel4459
左端引物序列，AAAATGTTTTACCACGCAAT
右端引物序列，ATAGGAAACAATGAACACGG；
7）标记引物，Indel4477
左端引物序列，TTCTTTAAGCAATCAAAGGG
右端引物序列，CGTCCTACATGTGCAAAATA；
8）标记引物，RM5436
左端引物序列，CAAAGGGGGTGTCCTCTATG
右端引物序列，GTTGCTCGTCCTACATGTGC。
2.水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记方法，其特征在于：通过权利要求1所述的任一引物对扩增待检水稻基因组DNA。
3.根据权利要求2所述的水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记方法，其特征在于：具体为：如果用引物RM3859能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物Indel4373能够扩增出175bp的扩增片段，或者用引物Indel4380能够扩增出172bp的扩增片段，或者用引物Indel4385能够扩增出186bp的扩增片段，或者用引物Indel4419能够扩增出162bp的扩增片段，或者用引物Indel4459能够扩增出173bp的扩增片段，或者用引物Indel4477能够扩增出191bp的扩增片段，或者用引物RM5436能够扩增出184bp的扩增片段，则判断为该待检水稻存在柱头外露率基因qSE7。
4.权利要求1的分子标记在选育高柱头外露率水稻中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 109207621 A
水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记及其方法和应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及水稻分子遗传育种学领域，具体是水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记及其方法和应用。
[0003]
背景技术
[0004]水稻是我国最主要的粮食作物，水稻产量的丰欠将直接影响到粮食安全和社会稳定。20世纪70年代中期杂交水稻的研究成功，大大提高了我国水稻的产量，然而现行的三系、两系育种体系由于不育系的异交性能差导致杂交制种产量低，制种成本高，极大的限制了水稻生产的大面积推广。水稻是自花授粉作物，花器构造适于自交而不利于异交，是杂交稻繁殖制种的限制因素之一。水稻柱头是接受花粉的器官，柱头外露率、柱头长和宽等性状决定母本的受粉能力，直接影响水稻不育系繁殖及杂交稻制种产
量。选育优良不育系，除应选择雄性不育和高配合力等特性外，还必须选择具有较高柱头外露特性。因此，研究不育系柱头外露特性是水稻育种家们的重要目标之一。
[0005]水稻柱头外露率是多基因控制的数量性状，各世代均呈连续性变异。针对柱头外露率性状，研究人员利用不同的分离体，基于连锁分析，进行了大量的QTL定位工作( 李晨等， 2001； 李文宏等，2003； Uga et al，2003；Yamamoto et al，2003 ；Yu et al，2006；沈圣泉等，2006； Miyata et al，2007；岳高红等，2009；Hu et al，2009；冯玲玲等，2010；邓应德等，2010；李海彬等，2010；陈爱国等，2011；尹成等，2014；Li et al，2014；Liu et al，2015；李威等，2017；Md Habibur Rahman et al，2017)。此外，还有学者利用BSA法和关联分析对柱头外露率进行QTL定位( 邓应德等，2011； Yan et al，2009；Dang et al，2016；Zhou et al，2017；Guo et al，2017)。定位的QTLs数目很多，分布在水稻的12条染体上，但是单个QTL解释的表型变异多在15％以内，表明柱头外露率是一个受多个微效QTL影响的典型的数量性状。像其他数量性状一样，柱头外露性状可在QTL定位后，通过分子标记进行辅助选择。尽管不同学者对柱头外露率进行了QTL分析，但各自的研究结果并不完全一致，这与不同研究中采用的体性质、体大小、分析方法、标记数量及密度等不同有关，同时反应出柱头外露性状QTL遗传的复杂性。目前，对水稻柱头外露率的QTL精细定位还报道甚少，迄今还没有QTL被克隆出来，更未进行基因功能与表达调控分析。
[0006]
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记及其方法和应用，通过检测与这些柱头外露率基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻植株的柱头外露率高低，提高柱头外露率改良育种效率，加快育种进程。
[0008]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记，其由下述之一的引物对经PCR扩增获得：
1）标记引物，RM3859
左端引物序列，TTGCAGATCGGTTTCCACTG
右端引物序列，GGTCCTGGATTCATGGTGTC；
2）标记引物，Indel4373
左端引物序列，AGTCTTTGATGGAAAGCTCC
右端引物序列，TATTCCCAAAATTTTCATGG；
3）标记引物，Indel4380
左端引物序列，AGGATCAGCTGAGAGACAAG
右端引物序列，ACGTCGCAGAAGATGATG；
4）标记引物，Indel4385
左端引物序列，TCAAGGACTAATTTGCAGAA
右端引物序列，AAGATGGCACTTTACTCAAT；
5）标记引物，Indel4419
左端引物序列，TCGCATTTGTGAATTAGTTG
右端引物序列，AGCATAGCTCTGAAAACAGG；
6）标记引物，Indel4459
左端引物序列，AAAATGTTTTACCACGCAAT
右端引物序列，ATAGGAAACAATGAACACGG；
7）标记引物，Indel4477
左端引物序列，TTCTTTAAGCAATCAAAGGG
右端引物序列，CGTCCTACATGTGCAAAATA；
8）标记引物，RM5436
左端引物序列，CAAAGGGGGTGTCCTCTATG
右端引物序列，GTTGCTCGTCCTACATGTGC。
[0009]水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记方法，通过上述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA。
[0010]优选的，水稻柱头外露率基因qSE7的分子标记方法具体为：如果用引物RM3859能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物Indel4373能够扩增出175bp的扩增片段，或者用引物Indel4380能够扩增出172bp的扩增片段，或者用引物Indel4385能够扩增出186bp的扩增片段，或者用引物Indel4419能够扩增出162bp的扩增片段，或者用引物Indel4459能够扩增出173bp的扩增片段，或者用引物Indel4477能够
扩增出191bp的扩增片段，或者用引物RM5436能够扩增出184bp的扩增片段，则判断为该待检水稻存在柱头外露率基因qSE7。[0011]分子标记在选育高柱头外露率水稻中的应用。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1. 通过本发明首次用SSR标记精细定位了水稻品种II-32B中的柱头外露率基因qSE7。[0013]
2. 通过本发明分子标记定位的柱头外露率基因位点明确，检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻柱头外露率表型，从而快速导入控制柱头外露率的QTL，提高选择效率，为杂交水稻不育系柱头外露率的提高和制种产量的提高提供帮助。检测方便
快速，不受环境影响。
[0014]
附图说明
[0015]图1：水稻柱头外露率基因qSE7在第7染体上的定位。
[0016]A：qSE7基因的初步定位，水平线表示第7染体，水平线上方表示初步定位的SSR 标记，水平线下方表示标记间的遗传距离（cM）；
B：qSE7基因的精细定位，qSE7精细定位于分子标记RM3859和Indel4373之间，水平线下方表示标记间的物理距离（bp）。
[0017]
具体实施方式
[0018]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0019]实施例，参阅图1，
（一）沪旱1B/II-32B BC3F2体构建
岳高红等（2009）利用沪旱1B/Ⅱ-32B构建的F2体对水稻的柱头外露率性状进行了QTL分析，初步定位到了1个同时影响单边柱头外露率和总柱头外露率的QTL- qSE7，位于第7染体分子标记RM3859和RM5436之间，加性效应来自高柱头外露率亲本II-32B。因此，以沪旱1B为轮回亲本，选择F2体中含有qSE7位点的单株与沪旱1B回交，获得BC1F1，然后利用分子标记RM3859和RM5436检测回交后代，选择两侧标记均为杂合基因型的单株继续与沪旱1B回交获得BC2F1，同样再选择两侧标记均为杂合基因
型的回交后代与沪旱1B回交获得BC3F1，然后自交收种获得6720个BC3F2体单株。
[0020]（二）构建的BC3F2体的分子标记分析
参考并比较已测序的水稻品系9311及日本晴在RM3859和RM5436之间相应的基因组序列，利用微卫星DNA位点查软件SSRHunter查SSR序列，利用分子生物学应用软件DNAMAN 比对发现Indel差异序列。将上述序列通过引物设计软件PRIME PRIMER 5设计。
[0021]按照常规CTAB法提取供亲本沪旱1B，II-32B及BC3F2体单株的DNA，用设计的Indel标记引物对亲本进行多态性筛选，PCR扩增反应体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10 uL Taq PCR Mastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10uM的前后引物各1uL，补充dd H2O至20uL。PCR扩增程序为： 95℃预变性5min，然后按95℃ 30 s，55℃下30 s，72℃下 45 s 进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min。PCR扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，最终在目标区间内从23个设计合成的Indel标记中获得6个标记引物在亲本间有多态性。
[0022]标记RM3859和RM5436之间的遗传距离为1.2 cM ，物理距离约200 kb。利用RM3859和RM5436从6720个BC3F2体单株中筛选出18株杂合重组单株，利用新设计开发的筛选获得Indel4373，Indel4380，Indel4385，Indel4419，Indel4459，Indel4477的6个多态性分子
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