(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710883356.8
(22)申请日 2017.09.26
(71)申请人 广州中国科学院先进技术研究所
地址 511458 广东省广州市南沙区海滨路
1121号
(72)发明人 刘陈立 李小明 张齐 崔金明
蒙海林 黄建东
(74)专利代理机构 广州番禺容大专利代理事务
所(普通合伙) 44326
代理人 刘新年
(51)Int.Cl.
C07K 14/47(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
A61K 47/42(2017.01)
A23L 33/19(2016.01)A23L 33/15(2016.01) (54)发明名称
用
(57)摘要
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种重
组牛β-乳球蛋白(BLG ),氨基酸残基序列如SQE
ID NO:1所示,优化核苷酸序列如SQE ID NO:2所
示。本发明还公开了一种重组牛β-乳球蛋白
(BLG)的制备方法,包括:将牛β-乳球蛋白(BLG)
优化基因整合到表达载体中,并用该载体转化宿
得到含有大量重组蛋白的发酵液;再对发酵液进
行纯化,获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白
(BLG),简化了牛β-乳球蛋白(BLG)的纯化工艺,
降低了生产成本。本发明的重组牛β-乳球蛋白
可用于制备药物载体或功能食品保护剂,使用更
安全。权利要求书1页 说明书4页序列表7页 附图3页CN 107501406 A 2017.12.22
C N 107501406
A
1.一种重组牛β-乳球蛋白,其特征在于,所述牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列如SQE ID NO.1所示。
2.一种重组牛β-乳球蛋白,其特征在于,编码所述牛β-乳球蛋白的优化的核苷酸序列如SQE ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的重组牛β-乳球蛋白,其特征在于,所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白氨基酸序列的相似度至少为85%。
4.根据权利要求3所述的重组牛β-乳球蛋白,其特征在于,所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白氨基酸序列的相似度为98%。
5.一种重组牛β-乳球蛋白的制备方法,包括以下步骤:
(1)优化牛β-乳球蛋白核苷酸序列;
(2)将(1)中优化的牛β-乳球蛋白核苷酸序列整合到表达载体中,并用该载体转化宿主细胞进行表达;
(3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞,得到含有大量重组蛋白的发酵液;
(4)再对(3)中发酵液进行纯化,获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组牛β-乳球蛋白的制备方法,其特征在于,所述特异性引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
7.根据权利要求5所述的重组牛β-乳球蛋白的制备方法,其特征在于,所述宿主细胞为食品级克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种。
8.权利要求1至4任意一项所述重组牛β-乳球蛋白或权利要求5至8任意一项所述方法制得的牛β-乳球蛋白在制备药物载体或功能食品保护剂方面的应用。
9.权利要求1至4任意一项所述重组牛β-乳球蛋白或权利要求5至8任意一项所述方法制得的牛β-乳球蛋白在制备维生素B11保护剂中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 107501406 A
一种重组牛β-乳球蛋白及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白组分,可溶性强,支链氨基酸含量丰富,是乳清蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸的主要来源,具有很强的凝胶和乳化功能,能与视黄醇等脂溶性维生素或脂肪酸结合。β-乳球蛋白可作为辅助性配料用于乳制品、焙烤食品以及运动饮料等食品工业,它为食品工业开发新产品提供了机会,具有很高的市场价值和潜力(2013,葛继文等)。
[0003]同时,食物中的维生素、脂肪酸、多酚等疏水小分子对机体代谢、疾病预防、抗氧化等有重要作用,但这类分子易受到光照、温度影响,很容易被氧化,且在人体胃肠道环境中容易丧失生物活性。β-乳球蛋白可以自动结合这类疏水分子,并对疏水配体的稳定性具有保护作用(2016,王枭鹏等)。
[0004]牛β-乳球蛋白(BLG)主要从牛乳中分离得到,但牛乳成分复杂,单乳清中的蛋白种类就有几十种。直接从牛乳中大规模分离β-乳球蛋白,面临着工艺复杂,成本高等问题。近年来,由于对食品安全的重视,人们对于动物来源制品的要求也越来越高。传统从牛乳中分离制备牛β-乳球蛋白(BLG)的方法,虽然通过后续各种检测方法能检测出已知病毒、细菌等污染物,但对于未知的病毒、细菌,显得无能为力。
而且一旦检测出病毒或细菌等污染,通过这种耗时耗力的方法获得的动物来源产品就要被销毁掉,这无疑是一种巨大的浪费。[0005]足见,现有技术还有待改善。
发明内容
[0006]有鉴于此,有必要针对上述的问题,提供一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)及其制备方法和应用,增加了牛β-乳球蛋白(BLG)的安全性,简化了牛β-乳球蛋白(BLG)的纯化工艺,降低了生产成本。
[0007]为达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
[0008]一种重组牛β-乳球蛋白(BLG),所述牛β-乳球蛋白(BLG)的氨基酸残基序列如SQE ID NO:1所示。
[0009]一种重组牛β-乳球蛋白(BLG),编码所述牛β-乳球蛋白(BLG)的优化核苷酸序列如SQE ID NO:2所示;优化前的核苷酸序列如SQE ID NO:3所示。
[0010]进一步的,所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)的氨基序列与自然型牛β-乳球蛋白(BLG)氨基酸序列相似度达到85%以上,最优选根据权利要求1所述的重组牛β-乳球蛋白(BLG),其特征在于,所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白(BLG)氨基酸序列仅3个氨基酸不同,相似度达98%。
[0011]一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)的制备方法,包括以下步骤:
[0012](1)优化牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列;
[0013](2)将(1)中优化的牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列(SQE ID NO:2)整合到表达载体中,并用该载体转化宿主细胞进行表达;
[0014](3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞,得到含有大量重组蛋白的发酵液;[0015](4)再对(3)中发酵液进行纯化,获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白(BLG)。[0016]进一步的,所述宿主细胞为食品级克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种;优选克鲁维酵母细胞。
[0017]进一步的,所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)或所述方法制得的牛β-乳球蛋白(BLG)应用于制备药物载体或功能食品保护剂。
[0018]进一步的,所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)或所述方法制得的牛β-乳球蛋白(BLG)应用于制备维生素B11保护剂。
[0019]本发明有益效果:
[0020]通过分子生物学方法克隆牛β-乳球蛋白(BLG)基因,然后将该基因整合到表达载体中,并用该载体转化各种宿主细胞进行表达;通过培养已转化的宿主细胞,得到的发酵液中含有大量的重组蛋白;然后,对发酵液进行纯化,获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白(BLG)。本发明简化了牛β-乳球蛋白(BLG)的纯
化工艺,降低了生产成本,更主要的是将本发明优化的牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列运用本发明的方法制备牛β-乳球蛋白(BLG),易于工业化生产,全程操作易控,特别是对于病毒、细菌或其他因素所带来的污染,能得到有效控制甚至完全避免。
[0021]克鲁维酵母是一般认为安全(GRAS,Generally Recognized as Safe,FDA认证)的菌株之一,利用基因工程的方法大规模分泌表达β-乳球蛋白,目的蛋白可以占到上清总蛋白的80%以上,利用这种方法获取具β-乳球蛋白有明显的优势。所获得的重组蛋白在食品和药物领域具有多种用途,具有免受动物病毒污染,纯度高,成本低等优点。
[0022]本发明获得的重组牛β-乳球蛋白(BLG)可以和维生素B11制备成络合物,对胃酸表现出了较好的耐受性,可以作为活性添加剂应用于食品工程、组织工程、药学以及美容护肤领域。
附图说明
[0023]图1为重组pKLAC1-BLG物理图谱。
[0024]图2为含有牛β-乳球蛋白(BLG)基因片段的核苷酸电泳;泳道1是分子量标准;泳道2为BLG扩增产物。
[0025]图3为含有牛β-乳球蛋白(BLG)基因的重组克鲁维酵母发酵上清SDS-PAGE实验结果:1为Marker;
2为牛β-乳球蛋白(BLG)发酵上清;3为阳性对照;4为空白对照。
[0026]图4为重组牛β-乳球蛋白(BLG)Western-blot实验结果;S1为发酵上清,S2为β-乳球蛋白标准品。
[0027]图5为β-乳球蛋白-维生素B11络合物在胃酸中的稳定性变化图(VB11为维生素B11对照),其中VB11为对照组,络合物为β-乳球蛋白与VB11络合物。
具体实施方式
[0028]为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果,现结合具体实施方式及相关实验进一步阐述。值得说明的是,本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
[0029]实施例1
[0030]重组牛β-乳球蛋白的表达
[0031]1、牛β-乳球蛋白(BLG)基因的克隆
[0032]根据NCBI公布的牛β-乳球蛋白的基因序列(SEQ ID No.3,NCBI登录号:X14712),利用OptimumGene按照宿主密码子偏好性对其对应的碱基序列进行优化,优化位点多达131处,优化之后更
有利于β-乳球蛋白在异源宿主克鲁维酵母或酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母、毕赤酵母等其他宿主细胞中的高效表达,并正确折叠包装。委托金斯瑞生物科技有限公司人工合成β-乳球蛋白成熟肽基因序列。对合成的基因用引入XhoI和NotI两端酶切位点,引入位点所用的引物为
[0033]P-F:5'CCGCTCGAGAAAAGAAAGTGCCTCCTG3’(XHO I)(SEQ ID NO:4)
[0034]P-R:5’CCTTTTGCGGCCGCCTAGATGTGGCACTGCTCC3’(NotI)(SEQ ID No:5)
[0035]PCR反应体系:引物P-F 1.5μL(10mM),引物P-R 1.5μL(10mM),模版质粒1μL(50ng/μL),EX-Taq酶(TaKaRa,货号RR001Q)0.5μL,补ddH2O至总体积50μL。PCR反应条件如下:94℃,2min;94℃,30s,55℃,30s,72℃,30s,循环30次;72℃延伸8min。扩增产物电泳(图2)显示500bp处有一条明亮的条带。然后委托英潍捷基公司对该PCR产物进行测序验证。[0036]2、构建重组表达载体pKLAC1-BLG
[0037]对获得的基因片段采用XhoI和NotI酶切,然后引入pKLAC1质粒(购于NEB公司)中,得到的重组质粒命名为pKLAC1-BLG(图1),经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司),序列正确(如SEQ ID No:4所示)。
[0038]酶切体系(50μL):限制性内切酶共2μL,酶切缓冲液5μL,质粒<1μg,剩余体积用水补齐。
[0039]连接体系(15μL):连接酶反应液7.5μL,长片段5μL,短片段2.5μL。
[0040]3、重组牛β-乳球蛋白的表达
[0041]将pKLAC1-BLG采用SacII线性化后,电转化感受态克鲁维酵母GG799(NEB, E1000S),电转化条件:0.2cm电转杯,3.0kV,电转一次。在终浓度为5mM乙酰胺的YCBA琼脂培养基上进行转化子筛选。
[0042]挑取转化子于YCBA平板上进行多次划线分离,经菌落PCR验证后,挑取单菌落于15mL YPD培养基中,30℃培养20h,3000g离心5min取上清进行SDS-PAGE。分析结果如图3,可以看出发酵上清中的产物蛋白质分子量均在18.4kDa左右(泳道2),符合标准牛β-乳球蛋白的分子量范围,可见牛β-乳球蛋白基因在克鲁维酵母中获得了高效表达,泳道3为牛血清蛋白对照,泳道4为空白对照。
[0043]其中,菌落PCR验证的上下游引物为:
[0044]P-F:5’GCGGATAACAAGCTCAAC3’
[0045]P-R:5’TTATCGCACAAGACAATC3’;
[0046]菌落PCR扩增步骤:98℃,10s;55℃,5s;72℃,1min;总反应循环数30次。
[0047]YCBA培养基:1.17%YCB,2%琼脂,5mM乙酰胺。