(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910520017.2
(22)申请日 2019.06.17
(71)申请人 郑州大学第一附属医院
地址 450052 河南省郑州市二七区建设东
路50号
(72)发明人 任志刚 洪良杰 崔光莹 孙冉冉
余祖江
(74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公
司 33212
代理人 朱莹莹
(51)Int.Cl.
A01K 67/02(2006.01)
A61D 1/00(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明专利属于医疗技术领域，具体涉及到
一种新型小鼠原位胆管癌模型及其建立方法。一
种新型小鼠原位胆管癌模型的建立方法，将100
微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液注入小
鼠右侧胆管内，所述溶液由成熟稳定的胆管癌细
胞株和凝胶液体组成。本发明采用小鼠肝胆管内
逆向注射(从胆总管向肝内胆管方向注射)胆管
癌细胞的方法构建小鼠的原位胆管癌模型，目
前，国内外没有成熟的小鼠胆管癌模型，本发明
填补了小鼠胆管癌模型的空白。权利要求书1页 说明书2页 附图2页CN 110214747 A 2019.09.10
C N 110214747
A
1.一种新型小鼠原位胆管癌模型的建立方法，其特征在于：将100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液注入小鼠右侧胆管内，所述溶液由成熟稳定的胆管癌细胞株和凝胶液体组成。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：胆管癌细胞株和凝胶液体的体积比为：1:4。
3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于：所述凝胶液体为基质胶。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：对balb/c -nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胆管和肝门部；将胆总管下端利用黄金夹夹住，封闭胆管；利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液，从右肝管注射胆管癌细胞进入右侧胆管内，使其充分进去右侧胆管，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胆管壁上针孔封闭；将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置，使细胞沉淀在胆管内；打开胆总管下端的黄金夹，保持胆道通畅；观察针孔处是否有破裂溢出胆汁，若没有溢出，将小鼠腹部缝合，完成模型建立。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：在16倍显微镜下进行。
7.权利要求1-6任一所述方法制备所得的小鼠原位胆管癌模型。
权 利 要 求 书1/1页CN 110214747 A
一种新型小鼠原位胆管癌模型及其建立方法
技术领域
[0001]本发明专利属于医疗技术领域，具体涉及到一种新型小鼠原位胆管癌模型及其建立方法。
背景技术
[0002]胆管细胞癌(cholangiocarcinoma)为仅次于肝细胞肝癌的第二大肝胆系统常见恶性肿瘤。据统计，肝胆恶性肿瘤总体死亡率在所有恶性肿瘤中居第5位。我国为胆管细胞癌高发地区，近年来发病率不断上升。其较肝细胞肝癌而言更具有侵袭性，仅30％-40％的病人在诊断时能通过手术切除得到有效的，而大多数患者确诊时已处于晚期，缺乏有效的手段，预后极差。因此，研究胆管癌的发病机制、寻胆管癌的新型靶点对于胆管癌的诊治具有重大意义。然而，目前国内缺乏可以使用的原位胆管癌模型，严重制约着胆管癌发病机制和诊治新策略的进一步研究。
发明内容
[0003]本发明专利的目的是提供一种新型小鼠原位胆管癌模型建立的方法。该方法能够稳定地建立一种小鼠的原位胆管癌模型，用于胆管癌发病机制的研究、胆管癌新型策略的研发和胆管癌新型方法预后的判断。
[0004]为实现上述目的，本新型发明专利采取的具体技术方案为：
[0005]一种新型小鼠原位胆管癌模型的建立方法，将100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液注入小鼠右侧胆管内，所述溶液由成熟稳定的胆管癌细胞株和凝胶液体组成。[0006]优选的，
[0007]成熟稳定的胆管癌细胞株和基质胶的体积比为1:4。
[0008]所述凝胶液体为基质胶(美国Corning公司)。
[0009]具体步骤为：对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胆管和肝门部；将胆总管下端利用黄金夹夹住，封闭胆管；利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液，从右肝管注射胆管癌细胞进入右侧胆管内，使其充分进去右侧胆管，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胆管壁上针孔封闭；将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置，使细胞沉淀在胆管内；打开胆总管下端的黄金夹，保持胆道通畅；观察针孔处是否有破裂溢出胆汁，若没有溢出，将小鼠腹部缝合，完成模型建立。
[0010]将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟。
[0011]在16倍显微镜下进行。
[0012]另外，本发明还提供了一种原位胆管癌小鼠模型，其建立方法为，将100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液注入小鼠右侧胆管内，所述溶液由成熟稳定的胆管癌细胞株和基质胶(美国Corning公司)
组成，成熟稳定的胆管癌细胞株和基质胶的体积比为1: 4。
[0013]具体步骤为：对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胆管和肝门部；将胆总管下端利用黄金夹夹住，封闭胆管；利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位胆管癌细胞的溶液，从右肝管注射胆管癌细胞进入右侧胆管内，使其充分进去右侧胆管，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胆管壁上针孔封闭；将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置，使细胞沉淀在胆管内；打开胆总管下端的黄金夹，保持胆道通畅；观察针孔处是否有破裂溢出胆汁，若没有溢出，将小鼠腹部缝合，完成模型建立。
[0014]本发明采用小鼠肝胆管内逆向注射(从胆总管向肝内胆管方向注射)胆管癌细胞的方法构建小鼠的原位胆管癌模型，在国际上属于首创。本发明建立的小鼠胆管癌模型能够为临床医生和科研工作者的基于动物模型的科学研究提供条件。目前，国内外没有成熟的小鼠胆管癌模型，本发明填补了小鼠胆管癌模型的空白。
附图说明
[0015]图1实验准备。
[0016]图2构建过程。
[0017]图3模型解剖症状及胆管肿瘤的组织病理学结构图。
具体实施方式
[0018]下列实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料如无特殊说明均为市购所得。
[0019](1)实验材料准备：超净工作台，无影灯，16倍显微镜(图1A)，4％水合氯醛，裸鼠固定板，纱布片，棉签，消毒酒精，胰岛素针，普通1ml注射器，眼科剪1把，显微眼科弯镊2把，显微持针钳1把，持针器1把，3-0的关腹线，医用胶带纸，眼科撑开器，黄金夹2个(图1B)，胆管癌细胞(图1C中由美兰代替)。balb/c-nu裸小鼠(图1D)(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
[0020](2)本模型所采用的技术方案：准备好现有成熟稳定的胆管癌细胞株和20％凝胶液体(防止细胞回流)，采用4％水合氯醛对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胆管和肝门部(图2)。在16倍显微镜下，将胆总管下端利用黄金夹夹住，封闭胆管。在肝门部上到右肝管，利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胆管癌细胞，在16倍显微镜下，从右肝管注射胆管癌细胞进入右侧胆管内(图2)，使其充分进去右侧胆管，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胆管壁上针孔封闭。将注射有胆管癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，使细胞沉淀在胆管内(图2)。20分钟后，打开胆总管下端的黄金夹，保持胆道通畅。观察针孔处是否有破裂溢出胆汁。若没有溢出，利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立(图2)。
[0021](3)本模型胆管癌的自然发展过程：该模型建立后，模型鼠从肿瘤生长至死亡，时间约为1个月左右。后期消瘦，精神状态直线下滑，多数伴有黄疸等症状。模型自然死亡后，解剖结构和症状如图3所示，胆管肿瘤的组织病理学结构如图3所示：胆管癌组织排列呈腺管状，癌细胞呈柱状或立方形，核大深染，异形明显，浸润性生长，侵犯全层。符合临床胆管癌的病理学特征。
图1
图2
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