(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910195758.8
(22)申请日 2019.03.14
(71)申请人 中国科学院生物物理研究所
地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号
(72)发明人 刘丹 阎锡蕴 段德民 郑继燕
张德玺 王艳芳
(74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任
公司 11021
代理人 张国梁 张莹
(51)Int.Cl.
G01N 33/53(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 21/76(2006.01)
(54)发明名称
用途
(57)摘要
本发明提供一种模拟HRP酶活性的纳米酶，
所述纳米酶为表面修饰有氯化血红素的铁基纳
米材料。本发明还提供所述纳米酶的制备和使用
方法及其用途。权利要求书1页 说明书10页 附图8页CN 111693689 A 2020.09.22
C N 111693689
A
1.一种模拟HRP酶活性的纳米酶，所述纳米酶为表面修饰有氯化血红素的铁基纳米材料。
2.权利要求1的纳米酶，其中所述铁基纳米材料选自Fe 3O 4纳米材料、Fe 2O 3纳米材料、掺入Co的铁基纳米材料或纳米水铁矿。
3.权利要求1的纳米酶，其中通过在铁基纳米材料的醋酸钠悬浮液中加入氯化血红素制备所述表面修饰有氯化血红素的铁基纳米材料。
4.权利要求1-3中任一项的纳米酶用于模拟HRP酶活性的用途。
5.一种用于检测液体样品中的待测物的纳米模拟酶化学发光免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：1)提供检测探针，所述检测探针通过将权利要求1-3中任一项的纳米酶与能够与所述待测物特异性结合的第
一分子偶联制备；2)提供捕获探针，所述捕获探针是固定化的能够与所述待测物特异性结合的第二分子；3)使所述液体样品与所述检测探针接触；
4)使与所述检测探针接触过的所述液体样品与所述捕获探针接触；以及5)向经过步骤4)的所述捕获探针加入鲁米诺类化学发光底物和激发剂进行化学发光催化反应。 6.权利要求5的方法，其中所述鲁米诺类化学发光底物选自鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
7.权利要求5的方法，其中所述激发剂是过氧化物或碱性氢氧化物。
8.权利要求5的方法，其中所述待测物是蛋白质、多肽或核酸，任选地所述第一分子和所述第二分子是针对所述蛋白质或多肽的特异性抗体，优选是单克隆抗体，或是针对所述核酸的适配体。
9.用于进行权利要求5-8中任一项的方法的纳米模拟酶免疫检测系统，所述系统是免疫微孔板检测系统、免疫层析检测系统(例如，免疫层析试纸条)或微流控免疫检测系统。
10.试剂盒，其包含下述任意一项或多项：1)权利要求1-3中任一项的纳米酶，2)权利要求5-8中任一项定义的检测探针、捕获探针、鲁米诺类化学发光底物和/或激发剂，和3)权利要求9定义的纳米模拟酶免疫检测系统。
权 利 要 求 书1/1页CN 111693689 A
一种用于酶促化学发光检测的纳米酶及其用途
[0001]本发明属于纳米技术及免疫检测技术领域，具体涉及能够高效催化鲁米诺类化学发光底物的无机过氧化物模拟酶及纳米酶化学发光免疫检测技术及其应用。
背景技术
[0002]目前，免疫检测技术相关产品占体外诊断领域40％的市场份额，现行免疫检测技术主要包括：放射性免疫分析法(RIA)、胶体金免疫层析法、酶联免疫分析法(ELISA)、时间分辨荧光法(TRFIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。其中放射性免疫分析灵敏度较高，但需使用放射性同位素，易造成放射性污染；胶体金免疫层析法灵敏度较低，仅适用于即时定性检测；ELISA技术较为成熟、成本低，适用于批量样品半定量检测，但操作繁琐耗时，依赖于HRP酶稳定性；TRFIA灵敏度较高，特异性较好，但需激发光源，且试剂成本较高。而CLIA不仅具有灵敏度高、特异性好、线性范围宽、无需外接光源、背景干扰小等优异性能，且操作简便、易于实现自动化，适用于高通量筛查或急诊术前检查，是目前最先进的体外免疫诊断技术。现阶段CLIA已成为体外诊断最大的细分领域，其临床应用需求巨大，且保持15％的增速，逐渐替代ELISA检测，成为免疫诊断行业的主流技术。
[0003]CLIA从原理上结合了免疫反应和化学发光反应：一方面通过抗原抗体反应特异结合待测物质，另一方面利用化学发光物质或能够催化化学发光底物的酶标记检测抗体，在激发剂和发光底物存在下，促使发光物质形成不稳定的中间体，当由激发态返回至基态时释放出光子，蓝光信号被化学发光仪采集；其中所结合待测物质的含量与化学发光强度呈正比，从而实现由光信号转换成待测物含量的定量分析[1]。根据固相载体的不同可分为板式化学发光和管式化学发光。板式化学发光检测，与ELISA类似，原料抗体包被及反应物结合在微孔板上；管式化学发光则采用超顺磁微粒作为固相载体，反应物结合于反应管中，外加磁场进行清洗。随着化学发光技术的不断演变迭代，根据发光底物和反应机理的不同，化学发光技术又可细分为：直接化学发光、酶促化学发光和电化学发光。直接化学发光包括：异鲁米诺和吖啶酯发光体系，第一代异鲁米诺直接化学发光试剂，由于性能不佳已被淘汰；吖啶酯直接化学发光为近年来新兴的第三代发光试剂，性能优异，发展迅速，但市场已被海外厂家(罗氏、雅培等)进口品牌所垄断。其中酶促化学发光主要分为：辣根过氧化物酶(HRP)-鲁米诺(Luminol)发光体系和碱性磷酸酶(ALP)-金刚烷(AMPPD)发光体系，以HRP-luminol发光体系最为常见，是我国体外诊断产业早期化学发光产品的主要形式，多用于肿瘤、传染病、激素、心血管疾病、肝功能、肾功能、代谢、药物浓度等项目检查[2]，后来逐渐被ALP酶促化学发光及直接化学发光产品挤占市场。第四代电化学发光技术灵敏度和准确度高，目前产品主要来源于进口厂家，如罗氏等，仪器及试剂多为封闭式系统，价格昂贵，应用推广有限。
[0004]由于化学发光技术壁垒高，研发难度较大，我国市场进口产品占比 80％以上；此外，由于化学发光试剂使用依赖于封闭式、高精密的自动化仪器，国内企业研发资金门槛高，试剂和仪器绑定销售，价格昂贵，因而国产化学发光产品在国内三甲医院等高端市场渗
透率不高，临床应用缺口较大，基层检验普及率不高，尚有较大的发展空间。在当前的市场经济形势下，进口产品价格上调，国产替代迫在眉睫。进口化学发光产品以全自动管式直接化学发光为主，而国产化学发光品牌多集中在半自动板式酶促化学发光产品。方法学和发光底物的选择，决定了酶促化学发光产品在灵敏度和准确性方面受限。HRP-luminol发光系统逐渐暴露出较多缺陷：第一，核心原料HRP属于生物蛋白酶，对酸碱度、温度十分敏感，叠氮化物、氧化物、硫化物等均可抑制其活性，稳定性较差，影响化学发光检测的准确性和稳定性；第二，HRP最适催化pH值(pH5.0左右)与鲁米诺底物发光反应最适pH值(pH11～pH12.0)不匹配，碱性条件下并不能最大限度的催化鲁米诺化学发光，需使用增强剂以提高化学发光强度及灵敏度；第三，高纯度的HRP多源自于进口，价格昂贵，试剂成本较高。上述瓶颈严重制约了HRP酶促化学发光产品的推广应用。
[0005]寻性能优良的过氧化物模拟酶替代HRP酶，将有助于克服上述局限和不足，在提高酶促化学发光检测灵敏度和稳定性的同时，降低试剂成本。目前，已发现的HRP模拟酶包括金属有机纳米片层等。据报道，贵金属、金属氧化物等纳米材料可用作化学发光反应的增敏剂、标记物或能量受体等，用于增强化学发光，制备小分子葡萄糖等生物传感器[3，4]。但实验表明，报道中的大多数纳米材料催化活性
较天然HRP酶低，尚不能替代HRP酶用于化学发光免疫检测。2007年，申请者所在实验室首次报道Fe3O4纳米材料具有内源过氧化物模拟酶特性[5]。研究团队同时利用铁基纳米酶催化HRP酶底物DAB显，开创了纳米酶免疫层析、免疫组化新技术，应用于环境监测、污水处理、传染病检测、疾病诊断等多个领域 [6，7]。但与天然酶相比，Fe3O4纳米酶活性及催化效率均有待进一步提高。
[0006]氯化血红素(Hemin)是一类含铁的天然卟啉化合物，作为辣根过氧化物酶HRP的辅基，能模拟过氧化物酶作用，具有一定的过氧化物酶催化活性，但因缺少HRP的蛋白结构，催化选择性不佳。因hemin具有π共轭结构，易于通过离子-π或π-π非共价键相互作用固定于其他材料表面 [8]，从而形成新的功能化复合材料。
发明内容
[0007]针对上述应用需求和现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有高过氧化物酶活性的纳米材料，以替代天然HRP酶高效催化鲁米诺类底物化学发光反应，建立新型纳米酶促化学发光免疫分析技术及平台，以突破上述背景技术中核心原材料HRP酶不稳定及催化效率不能最大化而导致的传统酶促化学发光免疫检测的局限性。本技术方法主要通过微孔板、免疫层析及微流控检测体系，实现高灵敏度化学发光免疫定量检测，为分子诊断、传染病检测、环境监测等提供新的技术手段；其中免疫层析及微流控检测体系操作简单快速，适用于现场即时检测(POCT)，本发明具有显著的创新性和潜在应用价值。
[0008]本发明首先提供一种具有较高内源过氧化物酶活性的纳米酶，其能替代天然HRP 酶，用于催化鲁米诺类底物化学发光，实现酶促化学发光技术核心原材料的国产替代。[0009]本发明所述纳米酶是在铁基纳米材料基础上通过修饰氯化血红素 (Hemin)而制得。其中铁基纳米颗粒可以是四氧化三铁(Fe3O4)纳米材料、三氧化二铁(Fe2O3)纳米材料、掺入Co的铁基纳米材料或纳米水铁矿等，优选是四氧化三铁(Fe3O4)纳米材料或掺入钴的铁基纳米材料 (Co-Fe)，最优选是掺入钴的铁基纳米材料(Co-Fe)。对于掺入钴的铁基纳米材料，在本发明优选的实施方案中，在制备中通过控制原料的投入量而使纳米材料所含的Co
与Fe的摩尔比例在1∶1～1∶4之间。
[0010]所述纳米材料表面修饰有羧基、氨基或巯基等基团，以便于偶联抗体。本发明所述纳米酶的粒径优选为10～300nm。
[0011]本发明的修饰氯化血红素的铁基纳米材料可以例如通过以下方法制备：通过在铁基纳米材料的醋酸钠悬浮溶液中，投入足量的Hemin溶液，快速搅拌反应即可。制备过程中Hemin可能通过离子-π或π-π堆积等非共价键相互作用固定到铁基纳米材料表面。根据复合材料的紫外可见吸收光谱在360～440nm处是否出现Hemin特征吸收峰来确定Hemin是否修饰成功。
[0012]本发明所述纳米酶在抗体标记后仍能高效催化化学发光底物(鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物)产生化
学发光，在部分实施例中，优选鲁米诺作为发光底物。
[0013]本发明所述纳米酶属于无机材料，对酸碱度不敏感，在较大的酸碱度范围(pH9.0～pH14.0)内对鲁米诺等发光底物保持较高的催化活性，而 HRP蛋白酶在超出pH8.5范围时对鲁米诺的催化活性急剧下降。
[0014]本发明所述纳米酶在低温或高温环境下(4～100℃)仍能保持对鲁米诺底物较高的催化活性，相对于HRP(100℃时失活)热稳定性更好。
[0015]本发明所述纳米酶在多种溶剂(水相、乙醇、DMSO等)均能保持较高的鲁米诺底物催化活性，而HRP在DMSO等溶剂中易失活。
[0016]本发明所述纳米酶的化学发光催化活性不易受防腐剂(如叠氮化钠等)的影响，易于长期保存。
[0017]本发明所述纳米酶在4℃或室温能够长期保存而不丧失催化活性，相对HRP酶(4℃仅能稳定保存1个月)更方便储存。
[0018]本发明另一个方面公开了一种高灵敏纳米酶促化学发光免疫检测分析方法，其基本原理结合了双抗夹心酶联免疫检测与纳米酶促化学发光反应，利用纳米酶抗体标记探针，特异性结合待测物质中抗原，并与固相包被抗体结合，形成纳米酶-双抗夹心复合物，在激发剂(H2O2和氢氧化物碱)存在下，纳
米酶氧化鲁米诺底物发出蓝光，根据化学发光仪器采集到的发光信号强度与待测物中抗原呈正比，从而实现由光信号转换成待测物含量的定量分析。根据固相包被载体及反应体系的不同，该方法原理可应用到微孔板、免疫层析及微流控等不同的纳米酶促化学发光检测体系。
[0019]本发明所述方法，主要通过以下技术方案及步骤实现：
[0020](1)制备纳米酶促化学发光检测探针；去离子水清洗纳米酶，超声分散，利用活化剂活化纳米酶表面基团；超声清洗后加入偶联缓冲液及一定量抗原特异性检测抗体，室温孵育偶联；磁吸附吸弃上清；加入Tris封闭缓冲液封闭纳米酶表面暴露的未结合活性位点，平衡缓冲液清洗后最后加入封闭液孵育纳米酶抗体标记探针，降低非特异性结合，最后用平衡缓冲液重悬并保存于4℃或固定到纳米酶结合垫上保存于4℃或室温。
[0021](2)包被固相抗体：使用包被缓冲液稀释抗原特异性捕获抗体，固定于固相表面如微孔板或硝酸纤维素膜或微流控芯片上，微孔板包被后进行清洗处理，硝酸纤维素膜包被后与背衬、吸收垫、样品垫、结合垫组装在一起制成试纸板，再作干燥处理。或在固相载体上包被链霉亲和素，其能够结合生物素标记捕获抗体。
[0022](3)与待测抗原结合形成复合物：在反应孔或纳米酶结合垫上使纳米酶促化学发
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