项目名称： | |
首席科学家： | 陈志南 中国人民解放军第四军医大学 |
起止年限： | 2009.1至2013.8 |
依托部门： | 陕西省科技厅 总后勤部卫生部 |
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本项目的关键科学问题是肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制。围绕细胞→不典型增生→原位癌→原发癌→转移癌的发生发展过程，筛选并确定肿瘤侵袭转移中参与肿瘤细胞恶性行为调控的关键分子/标志物，重点研究恶性肿瘤侵袭转移的分子调控机制，开拓肿瘤早期预测、诊断和调控阻抑的新方法、新领域。 本项目的主要研究内容：
本项目针对肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制关键科学问题，以筛选与肿瘤侵袭转移相关的新分子/标志物，开拓肿瘤早期预测、诊断和调控的新方法为目标，展开以下研究：
一、肿瘤发生/转移的分子基础研究
（1）癌基因及抑癌基因的分子平衡研究：选择癌基因如OPN、ras、myc等与抑癌基因如HTPAP、p53、PTEN等，进行分子间信号转导网络平衡研究，了解这些基因突变、异常表达及产物的异常激活与细胞周期和肿瘤侵袭转移的关系；（2）转移相关分子的功能研究：以已建立的转移模型与细胞系为载体，结合生物信息学方法，建立系统而有效的方法对筛选到的肿瘤转移相关基因进行鉴定。将利用基因克隆、RNA干扰、基因转染技术、基因敲除技术等结合免疫荧光显微术、流式细胞法、免疫沉淀和印迹、Transwell法、动物转移模型等手段，确定相关基因在肿瘤转移中的作用，发现关键的基因，阐述其作用机理，并评估其作为阻滞肿瘤转移的新药筛选靶标的价值；（3）转移相关分子的调控网络：应用模式生物、基因补偿、基因剔除、磷酸化、甲基化、糖基化、双荧光酶、双杂交及microRNA等技术，结合高通量技术及生物信息学技术探索转移相关分子调控网络；（4）肿瘤转移的分子干预：结合前一部分的基因/蛋白质组学研究发现，确立2-3个肝癌特异或可调控的具备功能的靶分子作为攻击目标（如OPN等），设计特异性的siRNA、反义核酸、或小分子多肽等，以本项目组建立的肿瘤转移模型和转移细胞系进行验证。完成临床前研究。
二、肿瘤发生发展过程与阻抑炎癌链的关键调控因子研究
拟采用分子病毒学、肿瘤免疫学和肿瘤细胞生物学等研究手段，在基因水平、蛋白水平、网络调控、实验动物和临床标本等多个层面研究肿瘤发生/发展和“炎癌链”中的关键调控基因和蛋白。
（1）探讨肿瘤免疫微环境对肿瘤转移的作用机制，明确炎癌链关键调控因子：研究乙型肝炎病毒x基因整合入肝细胞基因组与肝癌发生和转移的关系，揭示x基因在基因组中整合的规律，发现新的整合脆点，研究X蛋白的反式激活作用，探讨X蛋白与survivin蛋白的协同致癌作用，并阐述其分子机制。深入探讨炎癌链的关键调控因子如补体调节蛋白（CRP）、NF-B、免疫细胞和血小板等在肿瘤发生和转移中的作用，为临床早期诊断提供实验依据。
（2）肿瘤干细胞介导发生/转移的分子机制研究：利用不同的表面标志（如CD133，CD90等），分离和鉴定获得肝癌等肿瘤组织与细胞系中的肿瘤干细胞亚。检测肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞浸润能力的差异，建立相关的动物转移模型，检测不同细胞亚的转移能力，明确特定肿瘤干细胞在转移中的作用。分别从基因组和转录水平系统比较肿瘤细胞、肿瘤干细胞（迁徙性肿瘤干细胞）与普通干细胞之间的差异，分析并筛选在迁徙性肿瘤干细胞中可能发挥作用的基因与蛋白。在以上研究基础上，重点选择2－3个基因/蛋白进行研究，验证其在
肿瘤发生与转移中的作用，明确其发挥作用的信号通路与分子调控机制，探索其作为肿瘤靶标的可能性。
三、肿瘤侵袭转移相关分子与信号转导通路研究
（1）以本项目组开展的HAb18G/CD147、FAK、PI3K、Notch、NDRG2等关键信号分子的相互作用为切入点，利用免疫共定位、免疫共沉淀等分子生物学和蛋白组学的方法，研究肿瘤侵袭转移相关的信号通路构成及其相互串话（crosstalk）的关系；（2）肿瘤侵袭转移相关分子相互作用结构基础研究：利用生物大分子相互作用分析系统（Biacore）、蛋白分子核磁共振（NMR）或x-ray晶体衍射技术解析关键的肿瘤侵袭转移相关分子空间结构，分析分子间相互作用可能的结构域，确定关键结合位点氨基酸残基。位点突变后确定其结合活性和细胞生物学功能；（3）肿瘤侵袭转移相关分子调控网络研究：根据以上分子的相互作用关系和结构生物学分析，结合细胞生物学功能鉴定，绘制多阶段、多层次的肿瘤侵袭转移相关分子调控网络，并由此发现和鉴定新的关键分子，为靶向干预肿瘤的侵袭转移过程提供新靶点。
四、肿瘤发生/转移中细胞周期捕获、基质降解与血管生成研究
（1）肿瘤细胞周期调控关键分子研究：以RNAi、单抗封闭及check-in过表达等技术研究肿瘤相关分子HAb18G/CD147等对肿瘤细胞周期的影响，并进一步鉴定其下游调控的细胞周期相关蛋白，明确其信号转导通路；（2）研究细胞间信号分子（如CyPA）对肿瘤细胞周期功能的影响，并结合结构生物学和生物信息学预测结果，采用基因突变等方法，分析信号分子的相互作用关键残基位点；（3）筛选鉴定新型细胞周期调控相关的肿瘤转移关键分子，进行联合药物靶点细胞周期捕获研究；（4）鉴定CD146分子的天然配体，并系统研究其与CD146分子的相互作用机理及生物学功能，研究对CD146分子参与信号传导过程的逆向调控及抑制，丰富肿瘤血管生成机制的基础理论研究，为肿瘤血管靶向提供新的思路。（5）将本课题组前期开发的KH903 VEGFR融合蛋白序列及其shRNA表达框架插入到已制备的AFP、hTERT和COX-2调控的肿瘤裂解病毒，构建一种新型的抗新生血管生成的肝癌靶向性肿瘤裂解病毒，用于高效表达融合蛋白并有效抑制肿瘤组织的新生血管生成，同时能特异性地抑制VEGF/VEGFR的表达、并裂解肿瘤细胞，为临床肿瘤病人提供一条全新的肿瘤病毒基因思路。
五、肿瘤的早期预测与诊断
在前期研究基础上，进行HAb18G/CD147、OPN、HTPAP等分子在乳腺癌、肝癌、肺癌的预警、早期诊断、检测定位、反应、预后判断、复发监测等方面作为肿瘤标志物的临床评估，并探讨其机制。采用免疫组化及ELISA等方法，对不同分期的乳腺癌、肝癌、肺癌组织、癌前病变组织、正常组织及血清进行检测，分析其临床意义；并用分子原位杂交、微切割、RT-PCR技术，确定各分子mRNA在组织中的表达，结合免疫组化结果进行分析及统计学处理，综合评估该分子在肿瘤早期预测、诊断中的临床应用价值，并申报国家诊断用新药证书。
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