(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710131480.9
(22)申请日 2017.03.06
(71)申请人 苏州和锐生物科技有限公司
地址 215123 江苏省苏州市工业园区星湖
街218号B2-313室
(72)发明人 李振军 陈菲 周鹏飞
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种抑制TNF-α的生物制剂
血药浓度检测方法及检测试剂，其特征在于，包
中的单抗药物，形成单抗药物与抗体的复合物，
或单抗药物与亲和肽的复合物；2)用该单抗药物
强、灵敏度高、
重复性好等优点。权利要求书1页 说明书8页CN 108535490 A 2018.09.14
C N 108535490
A
1.一种生物制剂血药浓度检测方法，其特征在于，包括步骤，1)用抗生物制剂的抗体或亲和肽捕获血中的生物制剂，形成生物制剂与抗体的复合物，或生物制剂与亲和肽的复合物；2)用该生物制剂的抗原检测步骤1)的复合物。
2.权利要求1所述的抗生物制剂的亲和肽，其特征在于，用噬菌体展示技术筛选获得的能与生物制剂特异性结合的多肽。
3.权利要求1或2所述的亲和肽，其特征在于，亲和肽的序列与生物制剂的抗原序列完全不同，或同源性80％以下。 4.权利要求1所述的抗生物制剂的抗体，其特征在于，用生物制剂的特定可变区序列作为免疫源获得的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.权利要求4所述的免疫源，其特征在于，连接特定可变区序列的恒定区序列用动物源免疫球蛋白相应恒定区序列置换。
6.权利要求4或5所述的抗生物制剂多克隆抗体，其特征在于，通过免疫家禽获得的卵黄抗体IgY。
7.权利要求1所述的生物制剂的抗原，其特征在于，能与生物制剂结合的多肽或全长抗原蛋白。
8.根据权利要求1或7所述的生物制剂的抗原为TNF-a。
9.根据权利要求1-8任一所述的生物制剂，包括但不限于英夫利西单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、依那西普(Etanercept)、赛妥珠单抗(Certolizumab Pegol)和戈利木单抗(Golimumab)。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法制备一种生物制剂血药浓度检测试剂盒，其特征在于，包括不同浓度生物制剂制成的标准品、结合了抗生物制剂的抗体的固相载体、生物制剂的抗原标记物、发光底物。
11.根据权利要求10所述的抗原标记物，其特征在于，抗原标记物为抗原标记辣根过氧化物酶或抗原标记碱性磷酸酶或抗原标记吖啶酯。
12.根据权利要求1-10任一所述的方法制备一种生物制剂血药浓度检测试剂盒，其特征在于，包括存储有标准曲线信息的芯片或二维码，结合了抗生物制剂的抗体或亲和肽的荧光微球和免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包被有生物制剂的抗原。
权 利 要 求 书1/1页CN 108535490 A
生物制剂血药浓度检测方法及试剂
技术领域
[0001]本发明属于免疫检测领域，具体地涉及一种抑制TNF-α的生物制剂血药浓度检测方法及检测试剂。
背景技术
[0002]肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)，按其结构分两型：TNF-α和TNF-β，其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生的能使肿瘤坏死的因子称为TNF-α；而把由活化的T细胞和NK细胞产
生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)称为TNF-β。目前研究较多的是TNF-α，它是一种由157个氨基酸组成、相对分子质量为17kD的可溶性多肽，成熟型TNF-α的活性形式为三聚体。
[0003]TNF-α具有双重生物学效应，在浓度较低时，TNF-α主要作为白细胞和内皮细胞的自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡等；在高浓度时，过量的TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。TNF-α对众多的组织器官产生生物学效应，是细胞因子网络中一个重要的多功能成员，是机体维持内部自稳、抵御各种致病因子必不可少的免疫调节因子。
[0004]靶向TNF-α的性单抗是目前用于自身免疫性疾病最成功的一类生物制剂，可用于类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病及强直性脊柱炎。目前，抑制TNF-α的性单抗或生物制剂包括英夫利西单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、依那西普(Etanercept)、赛妥珠单抗(Certolizumab Pegol)和戈利木单抗(Golimumab)。这些生物制剂都能结合游离的以及膜结合的TNF-α，抑制其与受体结合，阻断其生物效应，但是不同形式的生物制剂通过不同的机制发挥作用。
[0005]这些生物制剂的应用，会出现自身抗体的诱导、不良药物反应(ADR)、生物利用度和抗体清除等问题，因此，检测患者血清中抑制TNF-α的生物制剂药物浓度，对于患者的用药有较大的指导意义，更有利于患者选择有针对性的方法。
[0006]检测TNF-α抑制剂的生物制剂血药浓度难点在于，结合TNF-α的不同抗体药物均不同程度地实现人源化，而且TNF-α有多个不同结合位点，使得检测某种抗体药很容易受到内源性抗体的干扰。国外在中国申请的专利No.102695955A公开了一种检测TNF-α抑制剂的方法：荧光标记TNF-α，然后检测样中加入一定量的标TNF-α标记物，标记物与样品中的抗体血药形成标记复合物，再进一步排阻层析，通过积分复合物峰曲线下面积测得TNF-α抑制剂的浓度，此种方法比较繁锁而且检测速度慢。邹有土、白羊、葛平辉等发表了《阿达木单抗ELISA定量检测方法的建立》(《中国医药生物技术》2015年第2期)，其检测阿达木的方法是以hTNF抗原为包被抗原，羊抗人IgG-HRP为检测抗体，建立了定量测定阿达木单抗的ELISA 方法，但这种方法对于TNF-α不抑制的抗体药存在明显的非特异性。本发明在抗制备生物制剂的抗体时，为了使制备的抗体具有高度特异性，针对性地把生物制剂的人源化序列置换为所免疫动物免疫球蛋白的相应恒定区序列，从而使本发明试剂比现有试剂具有更好的特
异性。中国专利CN201410619644.9公开了一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法，其特征是，通过利用链霉亲和素偶联的磁珠及生物标记的抗TNFRII单克隆抗体纯化正常人血清，去除内源性TNF-αRII的正常人血清作为待测样品的稀释液，以此来提高定量的灵敏度，但此方法显然也很繁锁，人血清存在风险，而且来源有限，不适宜商品化的诊断试剂生产，也不适用于其它生物制剂血药检测。
[0007]因此检测TNF-α抑制剂的血药浓度需要建立一种简便、快速、特异性高的方法。
发明内容
[0008]定义：
[0009]本文中术语“生物制剂”指通过抑制或阻断TNF-a的抗体或重组蛋白。
[0010]术本文中语“抗体”以最广义使用，且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段。
[0011]本文中术语“样品”指自患者获得的出于体外评估目的获得的生物学样品，所述样品是全血、血清或血浆。
[0012]方法：
[0013]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种生物制剂血药浓度的检测方法，克服已有方法操作复杂、特异性不强的弱点。
[0014]本发明提供一种生物制剂血药浓度的检测方法，其特征在于，包括步骤，1)用抗生物制剂的抗体或亲和肽捕获血中的生物制剂，形成生物制剂与抗体的复合物，或生物制剂与亲和肽的复合物；2)用该生物制剂的抗原检测步骤1)的复合物。
[0015]在一个较优地实施方案中，本发明所述的抗生物制剂的亲和肽，其特征在于，用噬菌体展示技术筛选获得的能与生物制剂特异性结合的多肽。
[0016]在一个较优地实施方案中，本发明所述的亲和肽，其特征还在于，亲和肽的序列与生物制剂的抗原序列完全不同，或同源性80％以下。
[0017]在一个实施方案中，本发明所述的抗生物制剂的抗体，其特征在于，用生物制剂的特点序列(单抗的可变区序列)作为免疫源获得的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0018]在一个实施方案中，本发明所述所述的抗生物制剂的多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为鸡源、兔源、羊源、马源、驴源中的一种，优选地，所述多克隆抗体为鸡源卵黄抗体IgY。
[0019]在一个实施方案中，本发明所述的生物制剂血药浓度检测试剂盒，其特征在于，包括不同浓度生物制剂制成的标准品、结合了抗生物制剂抗体的固相载体、酶标记的生物制剂的抗原、酶底物及显示剂。
[0020]在又一个实施方案中，检测标准品获得检测数据，用曲线拟合获得标准曲线，将标准曲线信息存储在芯片或二维码中。
[0021]建立在抗原-抗体特异性反应的免疫检测方法，关建是获得特异度高的抗体，但为了延长在体内的
半衰期和减少不良药物反应(ADR)，新一代的各种抑制TNF-α的生物制剂均不同程度地实现人源化，这使想要获得待测生物制剂的特异性抗体变得困难。通过基因工程技术获得待测抗体药物特异度高的抗原表位肽，再用高特异度的抗原表位肽通过传统抗体技术或基因工程抗体技术制备获得亲和肽、单抗或多抗。
[0022]本发明具有如下优点：
[0023]本发明避免内源性干扰，可实现高信噪比，有效排除样品基质的干扰，具有灵敏度高，特异性强、稳定性好等特点。
具体实施方式
[0024]实施例1 具有阿达木可变区特异性的鼠单抗的制备
[0025]根据已公开阿达木氨基酸序列，通过NCBI数据库比对，得到阿达木人恒定区氨基酸序列，将其与已知小鼠IgG1恒定区置换。通过构建真核共表达载体，在CHO-S细胞中瞬转，通过亲和层析纯化，获取高纯度鼠源化阿达木作为抗原，对Balb/c小鼠进行免疫。通过杂交瘤技术筛选具有阿达木特异性的单克隆抗体细胞株，制备抗体捕获或检测血样中阿达木浓度。
[0026]实施例2 具有依那西普特异性的鼠单抗的制备
[0027]根据已公开依那西普氨基酸序列，通过NCBI数据库比对，获取依那西普-TNF-α受体II肽序列，通过构建真核表达载体，用鼠IgG相应恒定区序列替换依那西普重链和轻链的恒定区序列，在CHO-S细胞中瞬转，表达出具有依那西普最小活性单位肽，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性肽。该活性肽该与KLH和BSA载体蛋白偶联，分别作为免疫抗原和筛选包被抗原，免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，通过杂交瘤技术筛选具有依那西普特异性的抗体的单克隆抗体细胞株，制备抗体捕获或检测血样中依那西普浓度。
[0028]实施例3 噬菌体展示筛选具有英夫利西单抗可变区特异性的亲和肽
[0029]一些病人服用英夫利西单抗一段时间后，体内产生大量针对英夫利西单抗的抗体。通过抽取病人外周血，使用淋巴细胞分离液获取病人淋巴细胞。使用RNA提取液，提取淋巴细胞中mRNA。设计针对人抗体重链和轻链引物，通过PCR获取抗体重链和轻链文库。设计柔性肽将重链和轻链连接，抗体以融合蛋白形式在丝状噬菌体衣壳表面表达。通过噬菌体展示技术，获取针对英夫利西单抗可变区特异性的抗体可变区基因。通过构建真核表达载体，CHO-S细胞中瞬转，表达出完整的英夫利西单抗可变区特异性的亲和肽，可捕获或检测血样中英夫利西单抗浓度。
[0030]实施例4 具有赛妥珠单抗可变区特异性的兔多抗制备
[0031]根据已公开赛妥珠单抗氨基酸序列，通过NCBI数据库比对，获取赛妥珠单抗重链和轻链可变区氨
基酸序列，用兔相应免疫球蛋白恒定区序列替换赛妥珠单抗重链和轻链的恒定区序列，通过构建真核表达载体，设计重链+柔性态+轻链组合，在CHO-S细胞中瞬转，表达出具有赛妥珠单抗最小单位，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性单位作为抗原，对大耳白兔进行免疫。通过对兔子股动脉采血，获取阳性血清使用辛酸-硫酸铵对血清中抗体进行沉淀、离心、复溶。将赛妥珠单抗偶联在NHS活化层析填料上，通过亲和纯化获取具有赛妥珠单抗可变区特异性的兔多抗，可捕获或检测血样中赛妥珠单抗。
[0032]实施例5 具有戈利木单抗可变区特异性的卵黄抗体制备
[0033]根据已公开戈利木单抗氨基酸序列，通过NCBI数据库比对，获取戈利木单抗重链和轻链可变区氨基酸序列，用鸡免疫球蛋白相应序列替换恒定区序列，通过构建真核表达载体，设计重链+柔性态+轻链组合，在CHO-S细胞中瞬转，表达出具有戈利木单抗最小单位，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性单位作为抗原，对蛋鸡进行免疫，使用水稀释法将
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