(10)申请公布号 CN 102358892 A
(43)申请公布日 2012.02.22C N 102358892 A
*CN102358892A*
(21)申请号 201110286472.4
(22)申请日 2011.09.23
C12N 5/10(2006.01)
(71)申请人安徽农业大学
地址230036 安徽省合肥市长江西路130号
(72)发明人曹鸿国 章孝荣 蒲勇 杨盼
张运海 刘亚 陶勇 方富贵
李运生 任春环 张子军 刘洪瑜
丁建平
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了牛iPS 细胞拟胚体的制作方
诱导和培养及鉴定、牛iPS 细胞的拟胚体制作、牛
iPS 细胞的拟胚体悬浮培养和牛iPS 细胞的拟胚
体体外分化能力检测。该制作方法形成的牛iPS
细胞拟胚体避免了传统拟胚体的悬滴操作、拟胚
体组成细胞纯度高、拟胚体组成细胞体外分化能
力强等特点，结果显示了牛iPS 细胞拟胚体的制
作方法具有实用性强、易操作和推广等优点。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页
1.一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤：
(1)细胞培养和慢病毒感染
取妊娠约2.5和4月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在293T细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液，病毒包装48h后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1.04×104/cm2，添加含终浓度为10μg/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔24h，细胞克隆形成后，1mg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养；诱导形成的牛iPS细胞经免疫荧光和碱性磷酸酶染检测验证；
(2)拟胚体的制作
取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入1mg/ml Dispase放置于培养箱消化10min，用手轻轻震动拍打培养皿，收
集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养；
(3)拟胚体的悬浮培养
接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；
(4)拟胚体的贴壁培养
拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。
牛iPS细胞拟胚体的制作方法
[技术领域]
[0001] 本发明涉及动物细胞的拟胚体制作方法，尤其涉及一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法。
[背景技术]
[0002] 胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)是一种来源于囊胚内细胞团的多能性干细胞体，具有较强的再生能力和可塑性，在体外培养环境条件下，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除或基因改造等遗传修饰操作。在一定的诱导环境条件下ES细胞能够分化形成机体所有类型的组成细胞，包括雌性的卵母细胞和雄性的精子。ES细胞向卵母细胞和精子的分化将会为转基因动物的生产、新品种培育、野生动物保护及人的生殖健康等奠定重要的基础，具有极强的应用价值和现实意义。
[0003] iPS细胞(Induced pluripotent stem cell)作为一种新型的多能性干细胞，与ES 细胞在细胞形态、增殖、基因表达和畸胎瘤形成、分化能力等方面具有相似或相同的特性。2006年日本科学家Yamanaka实验室率先利用逆转录病毒介导Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc 四个基因在小鼠成纤维细胞表达后，成纤维细胞转变成这种与小鼠ES细胞性能相似或相同的多能性干细胞被称为iPS细胞。高产优质牛的胚胎来源稀少，牛ES细胞分离培养成功率极低，牛iPS细胞的诱导仅需要优质种牛的部分皮肤细胞，则避免了牛ES细胞分离培养需要破坏大量高产优质牛的胚胎。同时，牛iPS细胞具有强大的可塑性，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除和基因改造等遗传修饰操作，利用基因工程修饰的牛iPS细胞诱导分化成精子或卵子，可以有效地解决目前转基因动物生产存在的目的基因表达率低、表达不稳定、转基因动物生产效率低等诸多问题。牛iPS细胞在体外向生殖细胞精子或卵子的分化过程中第一步则需要制作拟胚体，优质拟胚体的制作为牛iPS细胞在体外向生殖细胞精子或卵子的分化奠定重要基础。
[0004] 常规拟胚体的制作中使用胰酶-EDTA的消化液把干细胞连同饲养层细胞一起消化成单个细胞，把这些混合的细胞体采用倒挂细胞液形成悬滴，细胞液悬滴中的混杂细胞共同形成细胞团，这样形成的拟胚体细胞团中包含较多的饲养层细胞，由于饲养层细胞混杂在拟胚体中，极大地降低了拟胚体的质量，会导致下游的分化效率降低和分化质量下降，从而严重影响多能性干细胞向生殖细胞精子或卵子及其他类型细胞的分化效率，削弱多能性干细胞的临床和生产的应用价值和意义。
[发明内容]
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单，效果明显的牛iPS细胞拟胚体制作方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤：
[0007] (1)细胞培养和慢病毒感染
[0008] 取妊娠约2.5和4月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在293T细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液，病毒包装48h后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1.04×104/cm2，添加含终浓度为10μg/ml Polybren
e高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/mlLIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔24h，细胞克隆形成后，1mg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养；诱导形成的牛iPS细胞经免疫荧光和碱性磷酸酶染检测验证；
[0009] (2)拟胚体的制作
[0010] 取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入1mg/ml Dispa e放置于培养箱消化10min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养；
[0011] (3)拟胚体的悬浮培养
[0012] 接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；
[0013] (4)拟胚体的贴壁培养
[0014] 拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培
养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 本发明介绍的牛iPS细胞拟胚体制作方法步骤简单，制作的拟胚体质量优异。其制作的优质拟胚体将会为牛iPS细胞高效诱导分化及形成精子和卵子等奠定基础，同时也为使用牛皮肤来源细胞或其他类型的体细胞经iPS细胞转变成精子和卵子开辟了通道，对于利用现代生物技术加快牛的新品种培育具有着重要的意义。
[附图说明]
[0017] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0018] 图1是自然状态下牛iPS细胞在饲养层上的生长形态；
[0019] 图2是牛iPS细胞形成拟胚体的生长形态
[具体实施方式]
[0020] 一、材料和方法
[0021] (1)细胞培养和慢病毒感染
[0022] 取妊娠约2.5和4月龄荷斯坦奶牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液
分别建立牛胎儿成纤维细胞系。磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在293T细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液，病毒包装48h后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1.04×104/cm2，添加含终浓度为10μg/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔24h，细胞克隆形成后，1mg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养。
[0023] (2)免疫荧光和碱性磷酸酶染检测
[0024] 牛iPS细胞经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液通透，BSA的PBS溶液封闭后，一抗为Oct4、Nanog、SSEA-1按1∶200稀释后分别添加至细胞上孵育过夜，PBS洗涤，添加红荧光标记的二抗按1∶200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1μg/mL的DAPI 细胞核染，荧光镜下观察。牛iPS细胞经多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶染液进行染，以胞浆着为红棕或咖啡颗粒为阳性。
[0025] (3)拟胚体的制作
[0026] 取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入1mg/ml Dispase放置于培养箱消化10min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养。
[0027] (4)拟胚体的悬浮培养
[0028] 接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养。
[0029] (5)拟胚体的贴壁培养
[0030] 拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后用于体外三胚层分化能力检测。[0031] (6)拟胚体的体外分化检测
[0032] 牛iPS细胞体外分化拟胚体经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液通透，BSA的PBS溶液封闭后，一抗为α-actinin(Sarcomeric)、α-Fetoprotein(AFP)、Neurofilament200，一抗按1∶200稀释后
分别添加至细胞上孵育过夜，PBS洗涤，红荧光标记的二抗按1∶200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1μg/mL的DAPI细胞核染，荧光镜下观察。牛iPS细胞经多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶染液进行染，以胞浆着为红棕或咖啡颗粒为阳性。
[0033] 二、结果验证
[0034] (1)牛iPS细胞的形成
[0035] 牛胎儿成纤维细胞经过慢病毒的4次感染，慢病毒介导限定因子融合蛋白在牛胎
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