[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101122563A [43]公开日2008年2月13日
[21]申请号200710070564.2[22]申请日2007.08.28
[21]申请号200710070564.2
[71]申请人浙江省医学科学院
地址310013浙江省杭州市西湖区天目山路182
号
[72]发明人陈勇 沃恩康 洪艳 王怡婷 [74]专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司代理人韩介梅
[51]Int.CI.G01N 21/00 (2006.01)C12Q 1/68 (2006.01)C12Q 1/70 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，
特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒(Hep
atitis E virus，HEV)滴度的荧光定量PCR检测方
法。本发明包括如下步骤：病毒特异性定量PCR引
物和探针设计；标准分子的构建；病毒样本RNA的
提取；样本RNA的cDNA合成；荧光定量PCR检测方法
的建立和优化。本发明的检测灵敏度可达10°数量
级的病毒拷贝，具有良好的稳定性和特异性，可用
于大批量的样本检测，并可对样本的病毒载量进行
准确定量。
200710070564.2权 利 要 求 书第1/2页 1.一种戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征在于检测方法步骤如下：
(1).病毒特异性定量PCR引物和探针设计，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，在Genbank中检索戊型肝炎病毒全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为T A M R A，引物和探针位于戊型肝炎病毒O R F2区域，目的扩增片段为151bp，扩增序列为：
GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTA TTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTT TCTGTCCTCCGAGCT
引物和探针序列为：
上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；
下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；
T a q m a n探针序列：5’-F A M-C C G C A T G A C A T C G A C C T C G G G-T A M R A-3’；
(2).定量标准品的构建
根据确定的P C R引物，利用D N A重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pET-28a中，构建的重组质粒pET28a-ORF2作为检测戊型肝炎病毒滴度的定量标准品；
(3).样本中戊型肝炎病毒的分离及其RNA的提取，并针对病毒含量较低的样本用聚乙二醇和氯化钠进行浓缩，提高检测的灵敏度；
(4).对提取的样本RNA进行逆转录反应，获得样本cDNA；
(5).定量检测方法的优化和建立
通过筛选不同的Mg2+浓度、引物浓度、Taqman探针浓度，选择具有高灵敏度、合适反应效率的反应体
系和反应条件。并通过对反应体系的灵敏度、稳定性和特异性等指标对建立的荧光定量PCR方法进行综合评价；
(6).经过对临床标本的检测进行应用评估，验证建立的荧光定量PCR的可靠性。
200710070564.2权 利 要 求 书 第2/2页 2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量P C R检测方法， 其特征在于标准阳性模板核苷酸序列为：
GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTA TTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTT TCTGTCCTCCGAGCT
3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量P C R检测方法，其特征是所述的病毒特异性定量探针，指的是长度为21 bp的寡聚核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量P C R检测方法，其特征是所述的探针序列为CCGCATGACATCGACCTCGGG。
5.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量P C R检测方法，其特征是所述的探针5’端标记的荧光报告基团是FAM。
6.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量P C R检测方法，其特征是所述的3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
200710070564.2说 明 书第1/10页
戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的一种急性、自限性疾病。病毒主要通过粪-口途径传播，广泛流行于发展中国家，主要侵犯青壮年，孕妇感染后死亡率可达20％以上，构成严重的公共卫生问题。我国为戊型肝炎的高发区，控制该病刻不容缓。目前，对戊型肝炎的诊断除临床症状外，通常采用E L I S A法检测血清中抗H E V-I g G抗体。但是，目前E L I S A检测灵敏度及特异性较低，漏检率高，给戊型肝炎的诊治带来困难。而实时荧光定量PCR 作为一种新的技术已经广泛应用于疾病诊断，因此迫切需要建立一种灵敏、稳定、特异性强的荧光定量P C R方法，用于戊型肝炎的临床诊断及H
E V定量检测。建立该方法将为戊型肝炎的早期诊断，病程中粪便和血清中病毒载量的消长规律、抗病毒药物筛选、感染动物模型的研究提供方法；为戊肝的抗病毒效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的HEV污染状况，以及食品及生物制品的HEV检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。
荧光定量PCR技术具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、无污染、实时和准确等特点，已经广泛应用于病原体检测、单核苷酸多态性(SNP)测定及突变分析、基因表达分析、肿瘤基因检测等方面的研究。在病毒检测方面，它不仅能对病毒定性，更能快速、准确地定量病毒核酸，使研究病毒负荷和疾病进展的关系成为可能，从而可以动态地研究在整个病程中病毒载量的消长规律，并可对抗病毒的效果和耐药变异毒株的出现作出评估，为抗病毒药物的筛选以及研究工作提供有效的技术平台。目前，在国内外荧光定量PCR技术广泛应用于疾病的临床诊断，定量检测乙型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨细胞病毒、结核杆菌等各种病原体的商品化试剂盒已经面世，但是尚无H E V荧光定量P C R
200710070564.2说 明 书 第2/10页试剂盒问世。
戊型肝炎的实验室诊断常用酶联免疫法检测血清抗HEV-IgG和IgM，逆转录P C R方法检测粪便和血清中病毒R N A。但是，E L I S A检测戊型肝炎特异性抗体的敏感度有限，而且所用抗原不尽相同，导致检出率差异较大，随着人们发现的HEV基因型的日益增多，需要合成更多的抗原检测试剂，以降低漏检率。
而由于临床样本中的病毒含量非常低，常规RT-PCR方法灵敏度不够，易产生漏检。本发明采用绝对定量技术，建立灵敏、稳定、特异性强的荧光定量PCR检测HEV的方法，适用于戊型肝炎的临床诊断。
荧光P C R定量检测H E V方法的建立，将给戊型肝炎的诊断技术带来巨大飞跃；为抗病毒药物筛选、感染动物模型、患者发病过程中粪便和血清中病毒载量消长规律等方面的研究提供方法；为戊肝的抗病毒效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的H E V污染状况，以及食品及生物制品的H E V检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种HEV病毒的荧光定量P C R检测方法。该方法的检测灵敏度可达100数量级，较传统的R T-P C R和RT-nPCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大批量的样本分析，并对H E V进行定量，从而为戊型肝炎病毒的检测和监控提供有效方法。 本发明通过对G e n b a n k中H E V全序列进行生物信息学分析，选取H E V ORF2基因的保守区段为靶目标，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对P C R引物和T a q m a n探针。本发明所述的H E V特异性定量检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为151bp。 引物和探针序列为：
上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；
下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；
T a q m a n探针序列：5’-F A M-C C G C A T G A C A T C G A C C T C G G G-T A M R A-3’。 本发明包括如下步骤：
1.通过生物信息学分析，选择HEV ORF2基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：
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