(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810901217.8
(22)申请日 2018.08.09
(71)申请人 南昌大学
地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学
府大道999号
(72)发明人 赖卫华 陈媛 彭娟 章刚钢
黄震 邢克宇 熊勇华 魏华
许恒毅
(51)Int.Cl.
G01N 33/533(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 33/558(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了检测抗生素的荧光微球-胶体
金双显定性定量免疫层析试纸条及其制备方
法，在底板上依次地搭接粘贴滤纸、样本垫、喷涂
金-抗生素单克隆抗体复合物的玻璃纤维垫、硝
酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上包
被有抗生素偶联抗原作为检测线和包被有抗鼠
抗体作为质控线。检测线显比质控线显浅，
则样本中抗生素定性判断为阳性，阳性试纸条直
接插入荧光读取仪中，读取仪将荧光微球显体
系的荧光信号数值化，实现定量检测。本发明主
要用于食品安全检测中抗生素的定性与定量检
测。权利要求书6页 说明书29页 附图10页CN 108918860 A 2018.11.30
C N 108918860
A
1.一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，以及在
底板上依次地搭接粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所述的玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了抗生素单抗的复合物，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗生素人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线；
所述时间分辨荧光微球是直径为0.01～10μm的采用较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的特殊微球，其表面连接有活性基团；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点；
所述的胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，其表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联；
所述的抗生素抗体与标记物偶联的标记终浓度范围为0.5～200μg/mL，抗生素偶联蛋白质的偶联比范围为1:10～1:100，偶联抗原的喷膜浓度范围为0.1～10mg/mL；
所诉的荧光微球抗体复合物和胶体金抗体复合物，在每张试纸条中不同标记物上的抗体量范围为1～100ng/条。
2.如权利要求1所述的一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：
⑴硝酸纤维素膜的制备
①制备氯霉素人工抗原(CAP-BSA)
偶联方法为活泼脂法，偶联比为1:10-1:100，偶联后透析纯化，得到CAP-BSA；
②检测线和质控线的制备
CAP-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.5的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释CAP-BSA偶联物的浓度为0.6mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.6mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷膜体积均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干过夜，放置于干燥柜中保存备用；
⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备
①荧光微球标记氯霉素单克隆抗体的制备：取1mg荧光微球超声1min，用pH 8.0的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.05mg/mL，然后分别加入10mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)300μL和20mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)100μL(用pH 8.0的硼酸盐缓冲液溶解)，振荡混匀后，室温孵育30min后，1mL荧光微球中加入8μg氯霉素单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，6000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.03M pH 8.0的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为
起始体积后待用；
②胶体金标记氯霉素单克隆抗体的制备：取40mL胶体金(35nm粒径)，用碳酸钾溶液调节胶体金的pH为7.4，加入60μg氯霉素单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入1％的牛血清白蛋白4mL，封闭反应30min，5000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为1/10起始体积后待用；
③荧光微球抗体复合物和胶体金抗体复合物制备完成后，按照每张试纸条中不同标记物上的抗体量来计算，精确到胶体金标记抗体量为40ng/条、荧光微球标记抗体量为6ng/条的浓度来进行结合垫的喷涂，喷涂至30×0.8cm的玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于
干燥柜中备用；
⑶组装试纸条
①滤纸和样本垫规格为1×30cm；
②喷涂有荧光微球-胶体金复合物的玻璃纤维，规格为0.8×30cm；
③已喷好检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；
④吸水纸，规格为1.2×30cm；
⑤PVC底板，规格为5.5×30cm；
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
3.如权利要求1所述的一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：
⑴硝酸纤维素膜的制备
①制备磺胺二甲嘧啶人工抗原(SM2-BSA)
偶联方法为活泼脂法，偶联比为1:10-1:100，偶联后透析纯化，得到SM2-BSA；
②检测线和质控线的制备
SM2-BSA偶联物和抗兔抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.0的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释SM2-BSA偶联物的浓度为0.3mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗兔抗体的浓度为0.7mg/mL，
所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/ cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干过夜，放置于干燥柜中保存备用；
⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备
①荧光微球标记磺胺类多克隆抗体的制备：取1mg荧光微球超声1min，用pH 6.5的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后分别加入10mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)300μL和20mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)100μL(用pH 8.0的硼酸盐缓冲液溶解)，振荡混匀后，室温孵育30min后，1mL荧光微球中加入15μg磺胺类多克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，6000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH6.5的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为起始体积后待用；
②胶体金标记磺胺类多克隆抗体的制备：取40mL胶体金(40nm粒径)，用碳酸钾溶液调节胶体金的pH为6.2，加入120μg磺胺类多克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入1％的牛血清白蛋白4mL，封闭反应30min，5000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH6.2的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为1/10起始体积后待用；
③荧光微球抗体复合物和胶体金抗体复合物制备完成后，按照每张试纸条中不同标记物上的抗体量来计算，精确到胶体金标记抗体量为20ng/条、荧光微球标记抗体量为3ng/条的浓度来进行结合垫的喷涂，喷
涂至30×0.8cm的玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥柜中备用；
⑶组装试纸条：同权利要求2中试纸条组装步骤。
4.如权利要求1所述的一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：
⑴硝酸纤维素膜的制备
①制备β-内酰胺类抗生素人工抗原(以青霉素G为半抗原制备)
偶联方法为碳二亚胺法，偶联比为1:50-1:100，偶联后透析纯化，得到青霉素G-BSA；
②检测线和质控线的制备
青霉素G-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释青霉素G-BSA偶联物的浓度为1.2mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为1.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用；
⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备
①荧光微球标记β-内酰胺类抗生素单克隆抗体的制备：取1mg荧光微球超声1min，用pH7.4的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后分别加入60mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)300μL和30mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)100μL(用pH 7.4的硼酸盐缓冲液溶解)，振荡混匀后，室温孵育30min后，1mL荧光微球中加入15μgβ-内酰胺类抗生素单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，6000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为起始体积后待用；
②胶体金标记β-内酰胺类抗生素单克隆抗体的制备：取40mL胶体金(35nm粒径)，用碳酸钾溶液调节胶体金的pH为7.4，加入80μgβ-内酰胺类抗生素单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入10％的牛血清白蛋白4mL，封闭反应30min，5000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为1/10起始体积后待用；
③荧光微球抗体复合物和胶体金抗体复合物制备完成后，按照每张试纸条中不同标记物上的抗体量来计算，精确到胶体金标记抗体量为20ng/条、荧光微球标记抗体量为3ng/条的浓度来进行结合垫的喷涂，喷涂至30×0.8cm的玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥柜中备用；
⑶组装试纸条：同权利要求2中试纸条组装步骤。
5.如权利要求1所述的一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：
制备方法包括如下的步骤：
⑴硝酸纤维素膜的制备
①制备恩诺沙星人工抗原(ENR-BSA)
偶联方法为碳二亚胺法，偶联比为1:10-1:100，偶联后透析纯化，得到ENR-BSA；
②检测线和质控线的制备
ENR-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.5的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释ENR-BSA偶联物的浓度为1.7mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为1.5mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷膜体积均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用；
⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备
①荧光微球标记恩诺沙星单克隆抗体的制备：取1mg荧光微球超声1min，用pH 8.5的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后分别加入10mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)300μL(用pH 8.0的硼酸盐缓冲液溶解)，振荡混匀后，室温孵育30min后，1mL荧光微球中加入35μg恩诺沙星单克隆
抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，6000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH8.5的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-
20)复溶为起始体积后待用；
②胶体金标记恩诺沙星单克隆抗体的制备：取40mL胶体金(35nm粒径)，用碳酸钾溶液调节胶体金的pH为8.0，加入120μg恩诺沙星单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入1％的牛血清白蛋白4mL，封闭反应30min，5000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH 8.0的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为1/10起始体积后待用；
③荧光微球抗体复合物和胶体金抗体复合物制备完成后，按照每张试纸条中不同标记物上的抗体量来计算，精确到胶体金标记抗体量为50ng/条、荧光微球标记抗体量为7ng/条的浓度来进行结合垫的喷涂，喷涂至30×0.8cm的玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥柜中备用；
⑶组装试纸条：同权利要求2中试纸条组装步骤。
6.如权利要求1所述的一种检测抗生素的荧光微球-胶体金双显定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：
⑴硝酸纤维素膜的制备
①制备卡那霉素人工抗原(KAN-BSA)
偶联方法为碳二亚胺法，偶联比为1:10-1:100，偶联后透析纯化，得到KAN-BSA；
②检测线和质控线的制备
KAN-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 6.0的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释KAN-BSA偶联物的浓度为1mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为1.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/ cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用；
⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备
①荧光微球标记卡那霉素单克隆抗体的制备：取1mg荧光微球超声1min，用pH 6.0的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后分别加入30mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)300μL和50mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)100μL(用pH6.0的硼酸盐缓冲液溶解)，振荡混匀后室温孵育30min后，1mL荧光微球中加入12μg卡那霉素单克隆抗体，充分混合后室温搅拌反应3h，6000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.05M pH6.0的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为起始体积后待用；
②胶体金标记卡那霉素单克隆抗体的制备：取40mL胶体金(35nm粒径)，用碳酸钾溶液调节胶体金的pH为6.0，加入120μg卡那霉素单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入10％的牛血清白蛋白4mL，封闭反应30min，5000×g离心力离心20min，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01M pH 6.0的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为1/10起始体积后待用；
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