(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811622252.2
(22)申请日 2018.12.28
(71)申请人 山东省林业科学研究院
地址 250014 山东省济南市文化东路42号
申请人 山东华博基因工程有限公司
(72)发明人 吴德军 燕丽萍 王因花 姚俊修
任飞 王开芳 刘翠兰 束德峰
张子通
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人 李健康
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种利用毛细管电泳荧光SSR
指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法，是由白
蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA，并以提取的DNA
将PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据电泳结果
中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘青
碧’的SSR指纹图谱，实现对白蜡新品种‘青碧’的
鉴别。本发明方法中利用筛出特异性稳定、多态
性好的6对SSR特异引物，构建了白蜡新品种‘青
碧’的指纹图谱，能够简便、快速、准确地完成白
蜡新品种‘青碧’
样品的鉴定。
权利要求书2页 说明书6页序列表3页 附图3页CN 109593872 A 2019.04.09
C N 109593872
A
1.一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法，步骤是：
(1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物进行毛细管电泳；
(4)根据电泳结果中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱，实现对白蜡新品种‘青碧’的鉴别；
其特征是：
步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法，提取缓冲液中加入2％β-巯基乙醇和2％PVP；紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度，稀释至30ng·μl-1，-20℃保存，备用；
步骤(2)筛选出的SSR引物对为6对，分别是F82和R82，F93和R93，F95和R95，F120和R120，F123和R123，F167和167其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成；所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列，R82的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的正向引物序列，所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列，R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的正向引物序列，所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列，R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的正向引物序列，所述F120和R120引物对中F120的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列，R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的正向引物序列，所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列，R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的正向引物序列，所述F167和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列，R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的正向引物序列；
PCR反应体系为10μL：10ng.μL-1的DNA模板1μL、2X Taq plus PCR Master Mix 5μL、10μmol·L-1的正反向引物各0.1μL以及ddH2O共10μL；
PCR扩增程序采用Touchdown模式：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s；每个循环降低0.5℃；72℃延伸30s，15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
步骤(3)所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是：取PCR产物0.3μL、GS-500LIZ分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；采用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳：预电泳15kV下3min；
1.6kV下进样15s；电泳15kV下20min；
步骤(4)所述的鉴别方法是：采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱；其中，F82和R82引物对的峰值为250，F93和R93引物对的峰值为144/147，F95和R95引物对的峰值为150，F120和R120引物对的峰值为134，F123和R123引物对的峰值为142/148，F167和R167引物对的峰值为171。
2.用于权利要求1所述方法的SSR引物对，其特征是：所述SSR引物对为6对，分别是F82和R82，F93和R93，F95和R95，F120和R120，F123和R123，F167和167其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引
物组成；所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列，R82的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的正向引物序列，所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列，R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的正向引物序列，所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列，R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所
示的正向引物序列，所述F120和R120引物对中F120的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列，R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的正向引物序列，所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列，R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的正向引物序列，所述F167和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列，R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的正向引物序列。
3.权利要求2所述的SSR引物对在构建白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱中的应用。
4.一种白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱，其特征是：所述图谱由权利要求1所述方法构建获得。
5.根据权利要求4所述的白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱，其特征是：所述SSR指纹图谱中，SSR引物F82和R82引物对的峰值为250，F93和R93引物对的峰值为144/147，F95和R95引物对的峰值为150，F120和R120引物对的峰值为134，F123和R123引物对的峰值为142/ 148，F167和R167引物对的峰值为171。
一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种青碧
的方法
技术领域
[0001]本发明属于植物品种分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法。
背景技术
[0002]白蜡属植物为风媒花，混栽时很容易发生天然授粉杂交，尤其是绒毛白蜡(F.velutina)、红枔(F.pennsylvanica)、白枔(F.americana)等同为枔亚属样组，其形态特征非常相似，亲缘关系极为亲近，杂交后代传统的方法往往无法区分。‘青碧’为绒毛白蜡(FraxinusVelutina‘qingbi’) 雌株新品种，是由山东省林业科学研究院课题组培育的，2016年通过国家审定。该品种树干黄褐，当年生枝条微弯下垂，耐盐碱，应用范围广，适于园林绿化和造林。传统的白蜡分类鉴别主要依靠翅果、花、芽、叶及花粉粒等形态学标记，以翅果和花性状的差异最为明显，其次是芽、叶缘锯齿和果实缺刻被作为分类的依据。虽然形态标记研究简单直观且较经济，但有些不同种或品种间的形态特征极为相似，在种间交互难以区分，造成了白蜡属植物分类混淆问题，常出现同种多名称以及同名多品种的现象，导致白蜡命名上存在一些争议。在种质资源的鉴别中，仅依靠其形态性状，通常不能准确的反映不同品种的差别，因为形态性状极易受到环境的影响而发生变化，这给种或品种鉴别带来困难。在分子水平上对种质进行鉴定不受环境和生长阶段的影响，结果稳定，可靠性强。因此，寻求从分子水平真正准确识别白蜡良种极具现实意义。特别是在苗期的‘青碧’很难通过表型特征来进行鉴定，DNA分子标记的出现和快速发展，有望为‘青碧’的准确鉴定提供了一种新的技术手段。
[0003]简单重复序列(Simple5equencerepeat,SSR)分子标记具有信息含量高、共显性遗传、数量丰富、分析方法简单、结果重复性好、省时省力省钱等优点。目前SSR标记是种质鉴定方面最灵敏、最可靠的一种分子标记，已成为鉴别品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于玉米、水稻、大豆、小麦、棉花等作物中。但检索发现：利用毛细管电泳荧光SSR分子标记技术，开发基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’方法的专利未见报道。
发明内容
[0004]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是供用一种利用毛细管电泳荧光SSR 指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法。
[0005]本发明所述利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法，步骤是：
[0006](1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA；
[0007](2)以提取的DNA为模板，利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增；
[0008](3)将PCR扩增产物进行毛细管电泳；
[0009](4)根据电泳结果中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱，实现对白蜡新品种‘青碧’的鉴别；
[0010]其特征是：
[0011]步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法，提取缓冲液中加入2％β-巯基乙醇和2％PVP；紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度，稀释至30ng·μl-1，-20℃保存，备用；
[0012]步骤(2)筛选出的SSR引物对为6对，分别是F82和R82，F93和R93，F95和R95， F120和R120，F123和R123，F167和167其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、 HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成；所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列，R82的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的正向引物序列，所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列，R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的正向引物序列，所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列，R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的正向引物序列，所述F120和R120引物对中 F120的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列，R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的正向引物序列，所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9 所示的正向引物序列，R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的正向引物序列，所述F167 和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列，R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的正向引物序列；
[0013]PCR反应体系为10μL：10ng.μL-1的DNA模板1μL、2X Taq plus PCR Master Mix 5μL、 10μmol·L-1的正反向引物各0.1μL以及ddH2O共10μL；
[0014]PCR扩增程序采用Touchdown模式：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s；每个循环降低0.5℃；72℃延伸30s，15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
[0015]步骤(3)所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是：取PCR产物0.3μL、GS-500LIZ 分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心， 1×Buffer缓冲液上机检测；采用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳：预电泳15kV下3min； 1.6kV下进样15s；电泳15kV下20min；
[0016]步骤(4)所述的鉴别方法是：采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱；其中，F82和R82引物对的峰值为250，F93和R93引物对的峰值为144/147，F95和R95引物对的峰值为150，F120 和R120引物对的峰值为134，F123和R123引物对的峰值为142/148，F167和R167引物对的峰值为171。
[0017]本发明还公开了用于上述方法的SSR引物对，其特征是：所述SSR引物对为6对，分别是F82和R82，F93和R93，F95和R95，F120和R120，F123和R123，F167和167其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成；所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列，R82的核苷酸序列是
如SEQ ID No.2所示的正向引物序列，所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列，R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的正向引物序列，所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示
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