[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101328498A
[43]公开日2008年12月24日[21]申请号200810114618.5
[22]申请日2008.06.11[21]申请号200810114618.5
[71]申请人北京大学
地址100871北京市海淀区颐和园路5号[72]发明人赵美萍 李晓敏 宋晨 李元宗
[74]专利代理机构北京君尚知识产权代理事务所
代理人李稚婷
[51]Int.CI.
C12Q 1/44 (2006.01)C12Q 1/48 (2006.01)C12Q 1/68 (2006.01)G01N 21/64 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明提供了一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物DNA的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在DNA聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中所述单链核酸模板3’端具有与核酸酶作用产物片段相结合的特异结合区，5’端具有与通用分子信标相结合的通用序列区，当通用分子信标被核酸酶作用产物片段延伸后取代下来时荧光淬灭，从而产生可检测的信号。本发明可通用、低廉、灵敏、准确地应用于各种基因检测体系和相关的核酸酶活性分析，不仅操作方便，而且费用大大降低，对于各种疾病早期检测、疗效评价、人普查及遗传分
析等均有很高的实用价值。
200810114618.5权 利 要 求 书第1/2页 1.一种核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物DNA的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在DNA聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中：所述单链核酸模板包括：a)特异结合区，位于单链核酸模板的3’端，用于特异性结合核酸酶与底物DNA相互作用的产物片段；b)通用序列区，位于单链核酸模板的5’端，用于与通用分子信标核酸探针相结合；所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构时荧光淬灭，环部为15-30个碱基，茎部为4-7对互补碱基，环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列与单链核酸模板的通用序列区互补；单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T m值高于其特异结合区与核
酸酶作用的产物片段结合的T m值。
2.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述荧光基团为6-羧基荧光素、5-四氯荧光素、5-六氯荧光素、6-羧基罗丹明x、N，N′-对羧苄基吲哚三菁或6-羧基四甲基罗丹明，所述淬灭基团为4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸。
3.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的环部为十个AG的重复序列。
4.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的5’端茎部序列为5’-CCGGG-3’。
5.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T m值比其特异结合区与核酸酶作用产物片段结合的T m值高出2-20℃。
6.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述单链核酸模板特异结合区的长度为5-25bp。
7.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述核酸酶为DNA限制性内切酶或DNA磷酸激酶。
8.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述核酸酶为DNA限制性内切酶，其底物DNA在限制性内切酶识别序列两端的侧翼不超过6bp。
9.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述核酸酶为DNA磷酸激酶，在检测其去磷酸化活性时，所述单链核酸模板的3’端磷酸化，且在3’端形成自杂交的双链构型作为DNA磷酸激酶的作用底物。
10.如权利要求1～9中任一权利要求所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述DNA
200810114618.5权 利 要 求 书 第2/2页聚合酶具有链取代活性，而且没有3’外切活性。
200810114618.5说 明 书第1/8页
一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法
技术领域
本发明涉及限制性内切酶、磷酸激酶等核酸酶活性分析检测领域，更具体地，涉及一种通用序列模板分析核酸酶活性的方法。
背景技术
D N A是生命重要的遗传物质，这与各种核酸酶特殊的活性之间有着直接的关系。核酸酶的功能往往体现在与D N A的相互作用之中，例如，核酸的延伸、校正、连接、磷酸化、去磷酸化、酶切等重要的生命过程。因此，快速简便的核酸酶的动力学分析方法为研究生物多样性和深入理解生命现象有着重要意义。
核酸酶活性分析，通过研究酶切产物的方法有凝胶电泳、高效液相谱、filter binding 等。这些方法都是不连续性分析，操作麻烦、费时、费用高，无法快速、方便地获取分析结果，而且一般是采用放射性标记来提高灵敏度。采用增效应紫外分析法可进行酶切的连续检测，但是可检测底物浓度的范围较窄。酶联免疫吸附方法(E L I S A)也被用于酶切反应的研究，但也是一种不连续的分析体系。近几年来，随着荧光核酸探针的发展，出现了一些新的分析技术和方法来检测核酸的切割过程，主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA切割前后体系荧光的变化进行实时的监测。其中分子信标(Molecular Beacon)核酸探针应用最为广泛。分子信标是呈发夹结构的短链D N A，一端标记荧光基团，一端标记淬灭基团。在进行核酸酶活性分析中，将分子信标设计成特异的序列与核酸酶相互作用导致分子信标的构象发生变化，从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。对不同的核酸酶的活性研究，所采用的分子信标都是目标序列特异性的，对于不同的体系都要根据目标物重新设计分子信标，重新优化分子信标序列，优化反应条件，工作量大，设计繁琐，这些问题限制了其在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性，而且检测费用昂贵。最困难的问题之一是，在不同实验室的检测体系选用的分子信标探针序列不一样，检测模式差别较大，对于不同的核酸酶活性分析不易进行对比分析。
因此，迫切需要出开发普及性高、易用、灵敏、价廉、准确地核酸酶活性分析技术。发明内容
本发明的目的提供一种可用于检测核酸酶活性的易用、灵敏、低廉、准确的分析技术，
200810114618.5说 明 书 第2/8页以克服现有技术中的许多局限。
本发明的技术方案如下：
一种核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物D N A的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在D N A聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中：
所述单链核酸模板包括：a)特异结合区，位于单链核酸模板的3’端，用于特异性结合核酸酶与底物D N A相互作用的产物片段；b)通用序列区，位于单链核酸模板的5’端，用于与通用分子信标核酸探针相结合；
所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团(比如F A M，T E T，H E X，R O X，C Y5，T A M R A)，3’端标记淬灭基团(如D A B C Y L)，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构时荧光淬灭，环部15-30个碱基，茎部4-7对互补碱基，其中环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列与单链核酸模板的通用序列区互补。
上述单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T m值应高于其特异结合区与核酸酶作用的产物片段结合的T m值。
通用分子信标核酸探针的数量通常等于单链核酸模板的数量。当所述通用分子信标核酸探针与所述单链核酸模板特异性结合时释放荧光(如图1所示)，当通用分子信标核酸探针被核酸酶作用产物片段延伸后取代下来时荧光淬灭，从而产生可检测的信号。 分子信标常用的各荧光基团和淬灭基团的中英文全称见表1。
表1.分子信标5’和3’的荧光基团和淬灭基团标记的中英文全称
缩写英文全称中文名
FAM6-carboxy-fluorescein；494；518green6-羧基荧光素
TET5-tetrachloro-fluorescein 521；538orange5-四氯荧光素
HEX5-hexachloro-fluorescein 535；553；pink5-六氯荧光素
ROX6-carboxy-x-rhodamine；587；607；red6-羧基罗丹明x
CY5Indodicarbocyanine；643；667；violet N，N′-对羧苄基吲哚三菁
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine；560；582；rose6-羧基四甲基罗丹明
4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)
DABCYL4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoic acid
苯甲酸
本发明的核酸酶检测方法原则上归为引物扩增取代分子信标的反应，其关键是使用通
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