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一种大规模回收线性化质粒的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010174168.X

(22)申请日 2020.03.13

(71)申请人常州艾米能斯生物科技有限公司

地址 213000 江苏省常州市新北区寒山路7

号

(72)发明人孔维娟　宋彦凌　董庸行　

(74)专利代理机构常州市英诺创信专利代理事

务所(普通合伙) 32258

代理人王美华

(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

(54)发明名称

一种大规模回收线性化质粒的方法

(57)摘要

本发明公开了一种大规模回收线性化质粒

的方法，包括如下步骤：步骤1，限制性内切酶酶

切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7

μg/μl，限制性内切酶为PvuI酶，用量为每1μg

质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；步骤

2，酚氯仿异丙醇抽提；步骤3，醇沉获得线性化质

粒。本发明酶切体系，以PvuI酶酶切，并控制酶切

体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以

酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收

率提高至92％以上，甚至超过95％，将传统的质

粒回收率至少提高30％。此外，本发明的质粒回

收方法适用于大规模质粒回收。权利要求书1页说明书4页CN 111424030 A 2020.07.17

C N 111424030

1.一种大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，限制性内切酶PvuI的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI限制性内切酶进行酶切；

步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；

步骤3，醇沉获得线性化质粒。

2.根据权利要求1所述的大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：所述酚氯仿异丙醇抽提包括如下步骤：

1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；

2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

3)向剩余有机相中加入ddH 2O，充分混匀；

4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合。

3.根据权利要求1所述的大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：所述醇沉方法为：首先，向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH 2O溶解。

权　利　要　求　书1/1页CN 111424030 A

一种大规模回收线性化质粒的方法

技术领域

[0001]本发明属于生物技术领域，涉及质粒回收技术，具体为一种大规模回收线性化质粒的方法。

背景技术

[0002]现有技术中，线性化制粒回收方法主要过程为限制性内切酶酶切，酚氯仿异丙醇抽提，醇沉，过程中需要控制实验的体系及质粒的浓度，其中质粒需保持在较高的浓度，因此需控制酶切体系保持在较小的体积，一般限制性内切酶体系为NEB公司推荐的体系，酶切体系的质粒浓度较低，回收率仅为60～70％。传统的回收方法还有试剂盒回收，但试剂盒回收的话是针对微量的DNA的回收，回收柱的载体不超过20μg。另外PCR清洁试剂盒也可回收分子量在100bp-10kb左右的DNA，最高回收率可达95％，但均针对回收量在10ug以内的微量回收，对于大于10ug的回收无法保证回收率和回收量。

发明内容

[0003]为了克服上述现有技术中的问题，本发明提供一种大规模回收线性化质粒的方法。

[0004]为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：一种大规模回收线性化质粒的方法，：包括如下步骤：

[0005]步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，PvuI限制性内切酶的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；

[0006]步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；

[0007]步骤3，醇沉获得线性化质粒。

[0008]具体的，述酚氯仿异丙醇抽提包括如下步骤：

[0009]1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；

[0010]2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

[0011]3)向剩余有机相中加入ddH2O，充分混匀；ddH2O的用量一般与酶切体积相等；[0012]4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

[0013]5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合。

[0014]具体的，述醇沉方法为：首先，向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH2O溶解。[0015]与现有技术相比，本申请取得了如下技术效果：本发明酶切体系，以PvuI限制性内切酶进行酶切，并控制酶切体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收率提高至92％以上，甚至超过9

5％，将传统的质粒回收率至少

提高30％。此外，本发明的质粒回收方法实现了大规模质粒回收，比如1mg质粒回收，甚至是1mg以上的质粒回收。

具体实施方式

[0016]本发明下面结合实施例作进一步详述：

[0017]以下实施例中PvuI限制性内切酶为NEB公司(NEW ENGLAND BioLabs inc)生产。[0018]实施例1：

[0019]一种大规模回收线性化质粒的方法，包括如下步骤：

[0020]步骤1，限制性内切酶酶切

[0021]酶切体系如下：

[0022]

[0023]其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.7ug/uL。

[0024]步骤2，酚氯仿异丙醇抽提

[0025]1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；

[0026]2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

[0027]3)向剩余有机相中加入约100～200uLddH2O，充分混匀；

[0028]4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

[0029]5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合

[0030]步骤3，醇沉

[0031]向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH2O溶解。

[0032]实施例2

[0033]除了限制性内切酶酶切体系，其余步骤与实施例1相同，本实施例的限制性内切酶酶切体系如下：

[0034]

[0035]其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.663μg/μL

[0036]实施例3

[0037]

[0038]其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.124ug/uL

[0039]实施例4

[0040]

[0041]其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度2.721ug/uL

[0042]实施例5

[0043]

本文发布于:2024-09-20 20:21:35，感谢您对本站的认可！

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