(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201580031385.0
(22)申请日 2015.04.10
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 106461644 A
(43)申请公布日 2017.02.22
(30)优先权数据
61/978,158 2014.04.10 US
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2016.12.12
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2015/025432 2015.04.10
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2015/157704 EN 2015.10.15
(73)专利权人 耶鲁大学
地址 美国康涅狄格州
(72)发明人 I ·布赫米歇 C ·S ·布赫米歇 M ·霍马 H ·德格列 S ·M ·乔纳斯 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限公司 31266专利代理师 陆凤 马莉华(51)Int.Cl.G01N 33/52(2006.01)G01N 33/68(2006.01)(56)对比文件CN 103012599 A ,2013.04.03CN 101184533 A ,2008.05.21WO 2009/050711 A2,2009.04.23CN 102483418 A ,2012.05.30审查员 赵晓明 (54)发明名称
(57)摘要
本发明的各个方面和实施方案涉及用于鉴
定在其尿中具有错误折叠蛋白的受试者的方法
来自孕妇的尿样含有或不含错误折叠的方法和
组合物。在一些实施方案中，来自孕妇的尿样中
错误折叠蛋白的存在是先兆子痫的指示。权利要求书1页 说明书53页序列表5页 附图23页CN 106461644 B 2022.05.13 C N 106461644
B
1.一种用于确定来自孕妇的尿样含有或不含错误折叠蛋白的试剂盒，包括：
(a)与错误折叠蛋白结合和插入纤维素的染料，其中所述染料是刚果红；
(b)包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面，其中所述表面满足以下条件：
(1)如果包含错误折叠蛋白和染料的尿液溶液施加到所述表面，所述染料从该溶液施加的点径向扩散到纤维素表面；和(2)如果包含染料但不包含错误折叠蛋白的尿液溶液施加到所述表面，所述染料不从施加该溶液的点径向扩散到纤维素表面，或者，如果包含染料但不包含错误折叠蛋白的尿液溶液施加到所述表面，所述染料径向扩散的程度相对于包含错误折叠蛋白和所述染料的溶液更少；和
(c)阳性样品对照的图像，其中所述图像显示所述染料在所述表面上从施用所述阳性样品的斑点径向扩散。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，(a)所述阳性样品是包含错误折叠蛋白的尿液；和/或(b)所述包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面为纸张表面；和/或(c)所述包含纤维
素但不包含硝化纤维素的表面还包括粘合剂背衬，
任选地，所述包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面固定在另外的表面上；和/或(d)所述染料是在水溶液中，任选地，(i)所述染料在水溶液中的浓度为0.2％至1.0％；和/或(ii)所述水溶液的体积为1μl至10μl；和/或(h)所述试剂盒还包含阴性对照。
3.一种用于确定来自孕妇的尿样含有或不含有错误折叠蛋白的试剂盒，包括：
(a)与错误折叠蛋白结合和插入纤维素的第一染料，其中所述第一染料是刚果红；(b)与第一染料颜不
同且不结合错误折叠蛋白和纤维素的第二染料；
(c)包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面，其中所述表面满足以下条件：(1)如果包含错误折叠蛋白和染料的尿液溶液施加到所述表面，所述染料从该溶液施加的点径向扩散到纤维素表面；和(2)如果包含染料但不包含错误折叠蛋白的尿液溶液施加到所述表面，所述染料不从施加该溶液的点径向扩散到纤维素表面，或者，如果包含染料但不包含错误折叠蛋白的尿液溶液施加到所述表面，所述染料径向扩散的程度相对于包含错误折叠蛋白和所述染料的溶液更少；和
(d)阳性样品对照的图像。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，(a)所述第一染料是刚果红，所述阳性样品是包含错误折叠蛋白的尿液；和/或(b)所述第二染料是羊毛罂红；和/或(c)所述包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面是纸张表面；和/或(d)所述包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面还包括粘合剂背衬，任选地，其中，所述包含纤维素但不包含硝化纤维素的表面固定在另外的表面上；和/或(e)所述第一染料和第二染料在水溶液中合并，从而产生两种染料的水溶液，任选地，其中，两种染料在水溶液中的浓度为2％至10％；和/或(f)所述水溶液的体积为1μl至10μl；和/或(g)还包括阴性对照。
5.一种包含权利要求1、2、3或4所述的试剂盒和来自孕妇的尿样的装置。
6.一种权利要求1或3所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于制备确定来自孕妇的尿样含有或不含错误折叠蛋白的检测试剂盒。
7.一种权利要求1或3所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于制备确定孕妇是否患有先兆子痫或处于患有先兆子痫的风险的检测试剂盒。
权 利 要 求 书1/1页CN 106461644 B
检测错误折叠蛋白的方法和组合物
[0001]相关申请
[0002]本申请基于35U.S.C.§119(e)要求2014年4月10日提交的美国临时申请号 61/ 978,158的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。
[0003]领域
[0004]本发明的诸方面涉及诊断和预后领域。
[0005]背景
[0006]先兆子痫(PE)是妊娠特异性高血压病症，并且是全世界产妇和围产期发病率和死亡的主要原因。世界卫生组织(WHO)估计，全球产妇死亡率(每年约63,000例产妇死亡)有16％是单由PE所致。在美国，先兆子痫影响所有妊娠的 5‑8％或27万妇女，每年造成18％的产妇死亡并且发生率正在上升。婴儿也有风险；由于先兆子痫，在美国每年有10,500名婴儿死亡。
[0007]先兆子痫根据观察到的症状诊断。没有用于先兆子痫的准确诊断产品。
[0008]在资源有限的情况下，产妇死亡的风险要高得多。导致大部分产妇和胎儿死亡的最常见的因素是未能及时识别先兆子痫。这是一个主要障碍，因为它不能将具有先兆子痫的女性转移到更高水平的医疗机构，在那里她可以用镁、类固醇和/或在子痫，产妇高血压中风或因剥离导致的胎儿死亡之前紧急分娩。先兆子痫是一种不断发展的病症。因此，改善对临床上无症状或不清楚有先兆子痫症状的妇女的先兆子痫的检测将具有显著的临床重要性。这种策略称为二级先兆子痫预防，并且具有通过预防由于惊厥、中风、肺水肿、肝和/或肾衰竭和产妇死亡引起的子痫和末端器官系统损伤而减少妊娠相关死亡率和发病率的潜力。
[0009]一旦诊断出严重先兆子痫(sPE)，硫酸镁、抗高血压药物和医学指示的分娩是已经被证明可以挽救生命的策略(称为三级先兆子痫预防的策略)。对于早产，安排医学指示分娩的正确时间以允许保守(例如类固醇)对于改善新生儿结果也是已知的。用于预防先兆子痫并发症的策略的使用是以对这种病症的准确诊断为条件。
[0010]简述
[0011]先兆子痫是人类妊娠特有的高血压蛋白尿综合征。诊断先兆子痫的一个问题是高血压和蛋白尿都不灵敏或特异，特别是在具有非典型表现的妇女中。先兆子痫妇女的尿高度富集错误折叠蛋白。由于错误折叠蛋白的这种富集，使用对错误折叠蛋白具有亲和力的染料的简单染试验可用作先兆子痫的诊断和临床预后工具。一种这样的染料测试的实例是刚果红点测试(Congo Red Dot test)，其包括使用对错误折叠蛋白具有亲和力(例如，结合能力)的偶氮染料刚果红。
[0012]在一些实施方案中，本文提供了解决用于评估蛋白尿的典型尿液试纸的限制的科学和技术方法。在一些实施方案中，本文提供了允许在短时间(例如2 分钟)内产生半定量结果的基于纸的方法(在一些实施方案中，称为刚果红点简易试剂盒)。在一些实施方案中，本文还提供了用于图像分析的基于智能手机的方法(在一些实施方案中，称为刚果红点定量试剂盒)，其有潜力地允许在短时间(例如，7分钟)内定量和无偏差地评估尿中的错误折
叠蛋白，例如，以解决在医疗机构(例如资源有限的医疗机构)中不能完成24小时蛋白尿评估。
[0013]应当理解，刚果红是可以根据本发明使用的染料的一个非限制性实例。为了简单起见，本文所述的测试和试剂盒具体参考刚果红(例如刚果红点简易试剂盒)；然而，在一些实施方案中，可以使用除了刚果红之外的对错误折叠蛋白具有亲和力的染料，并且如下所述，可以使用纤维素。类似地，提及“
尿嗜刚果红性(urine congophilia)”，其指具有结合刚果红的错误折叠蛋白的尿。应当理解，该术语并不意在限制。嗜刚果红的蛋白质也可以对可用作刚果红替代品的其它染料具有亲和力。
[0014]本发明的一些方面提供了确定从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)含有或不含有错误折叠蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括 (a)将从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)与结合错误折叠蛋白和含有游离羟基的材料(例如纤维素)的染料混合，从而产生一溶液(例如，尿液和染料的溶液)；(b)在染料结合错误折叠蛋白和含有游离羟基的材料(例如纤维素)的条件下，将溶液施加到包含含有游离羟基的材料(例如，纤维素)的表面，从而在表面上产生斑点(例如，包含染料的斑点)；(c)在溶液(例如，包含错误折叠蛋白和染料的尿液)发生扩散的条件下，保持表面上的斑点；和(d)如果染料从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)至可感知的程度，则确定样品(例如，尿样)包含错误折叠蛋白，或者如果染料不从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)到可感知的程度，则确定样品(例如，尿样)不包含错误折叠蛋白。在一些实施方案中，染料结合错误折叠蛋白和含有游离羟基的材料的条件包括室温(例如～25℃)条件下30分钟至3小时或更长(例如30分钟，1小时，2小时或3 小时)。
[0015]本发明的一些方面提供了检测从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)中的错误折叠蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)将从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)与结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料(例如，纤维素)的表面的染料混合，从而产生该样品(例如，尿液)和染料的溶液；(b)在所述染料结合错误折叠蛋白、结合包含含有游离羟基的材料的表面、或结合
错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料的表面的条件下，将所述溶液施加到包含含有游离羟基的材料的表面，例如包含纤维素的表面，从而在表面上产生斑点；(c)在溶液(例如，包含错误折叠蛋白和染料的尿液)发生扩散的条件下，保持表面上的斑点；和(d)如果染料从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)至可感知的程度，则检测样品(例如，尿样)中的错误折叠蛋白，如果染料不从表面上的斑点扩散(例如，不以径向扩散)到可感知的程度，则不检测样品(例如，尿样)中的错误折叠蛋白。
[0016]本发明的一些方面提供了检测从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)中的错误折叠蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)将从受试者(例如，孕妇)获得的样品(例如，尿样)与结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料(例如，纤维素)的表面的染料混合，从而产生样品(例如，尿液)和染料的溶液；(b)在所述染料结合错误折叠蛋白、结合包含含有游离羟基的材料的表面、或结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料的表面的条件下，将所述溶液施加到包含含有游离羟基的材料的表面，例如包含纤维素的表面，从而在表面上产生斑点；(c)在溶液(例如，包含错误折叠蛋白和染料的尿液)发生扩散的条件下，保持表面上的斑点；和(d)确定染料是否从表面上的斑点扩散到可感知的
程度，其中，如果染料扩散到可感知的程度，则在样品(例如，尿样)中检测到错误折叠蛋白，如果染料不扩散到可感知的程度，则在尿样中没有检测到错误折叠蛋白。
[0017]本发明的一些方面提供了确定从孕妇获得的样品(例如，尿样)含有或不含错误折叠蛋白的方法，
包括(a)将从孕妇获得的样品(例如尿样)与结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料(例如，纤维素)的表面的染料混合，从而产生样品(例如尿)和染料的溶液；
(b)在所述染料结合错误折叠蛋白、结合包含含有游离羟基的材料的表面，或结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料的表面的条件下，将所述溶液施加到包含含有游离羟基的材料(例如，纤维素)的表面，从而在所述表面上产生斑点；(c)在溶液(例如，包含错误折叠蛋白和染料的尿液)发生扩散的条件下，保持表面上的斑点；和(d)如果通过表面的溶液被着，则确定样品(例如，尿样)包含错误折叠蛋白，或者如果通过表面的溶液是无的，则确定样品(例如，尿样)不包含错误折叠蛋白。
[0018]在一些实施方案中，方法还包括比较溶液(例如尿液和染料的溶液)从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)的程度与阳性对照扩散的程度，并且，如果溶液(例如，尿液和染料的溶液)从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)的程度与阳性对照中扩散发生的程度相当，则确定样品(例如，尿样)包含错误折叠蛋白。
[0019]在一些实施方案中，方法还包括比较溶液(例如尿液和染料的溶液)从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)的程度与阴性对照扩散的程度，并且，如果溶液(例如，尿液和染料的溶液)从表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)的程度与在阴性对照中扩散发生的程度相当，则确定样品(例如，尿样)不包含错误折叠蛋白。
[0020]在一些实施方案中，方法还包括(e)稀释孕妇的另外样品(例如尿样)，从而产生稀释的样品(例如稀释的尿样)；(f)将稀释的样品(例如尿样)与结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料(例如纤维素)的表面的染料混合，从而产生溶液(例如尿液和染料的溶液)；(g)在染料结合错误折叠蛋白、结合包含含有游离羟基的材料的表面、或结合错误折叠蛋白和包含含有游离羟基的材料的表面的条件下，将溶液(f)施加到包含纤维素的表面，从而在表面上产生斑点；(h)在溶液(例如，包含错误折叠蛋白和染料的尿液)发生扩散的条件下，保持表面上的斑点；和(i)如果染料从步骤(h)的表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)，则确定稀释的样品(例如，尿样)包含错误折叠蛋白，或如果染料不从维持在(h)的表面上的斑点扩散(例如，径向扩散)，则确定样品(例如，尿样)不包含错误折叠蛋白。
[0021]在一些实施方案中，将另外样品(例如，尿样)稀释至进行该方法的条件所需的程度，例如，5倍至15倍(例如，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍， 12倍，13倍，14倍或15倍)。[0022]在一些实施方案中，受试者是孕妇。在一些实施方案中，受试者是怀疑患有先兆子痫的孕妇。在一些实施方案中，受试者是处于先兆子痫发展风险(例如，遗传易患的或先前患有的)的孕妇。在一些实施方案中，如果样品(例如，尿样) 含有错误折叠蛋白或如果检测到错误折叠蛋白，则所述方法还包括诊断孕妇患有先兆子痫或可能发展为先兆子痫。[0023]在一些实施方案中，染料是刚果红。
[0024]在一些实施方案中，溶液中染料的浓度为0.05％至0.2％。例如，溶液中染料的浓度可以为0.1％。
[0025]在一些实施方案中，含有游离羟基的材料是纤维素。在一些实施方案中，表面是纸或含有纸。
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