(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810390167.1
(22)申请日 2018.04.27
(71)申请人 吉林大学
地址 130012 吉林省长春市前进大街2699
号
(72)发明人 王依楠 刘静波 张婷
(74)专利代理机构 长春市恒誉专利代理事务所
(普通合伙) 22212
代理人 李荣武
(51)Int.Cl.
C12N 5/0786(2010.01)
(54)发明名称
方法
(57)摘要
本发明涉及一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症
模型的建立方法，通过LPS体外处理RAW264.7细
胞，LPS浓度为1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。
本发明利用不同浓度LPS作用不同时间，通过MTS
检测细胞存活率，检测细胞因子TNF-α，IL-6和
IL-1β的分泌，检测NO的释放等指标，为探究LPS 体外诱导RAW264.7细胞炎症与免疫之间的关系
和免疫相关疾病的发生机制提供了理论基础，同
时也为深入研究炎症的感染机制和开发用于炎
症感染的制剂提供技术基础和理论参考。权利要求书1页 说明书3页 附图3页CN 108486056 A 2018.09.04
C N 108486056
A
1.一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：采用LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度为1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。
2.根据权利要求1所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述LPS浓度为1
00ng/ml，处理时间为16h。
3.根据权利要求1所述的LPS诱导RAW26
4.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)设置空白组、对照组和实验组；在96孔板中空白组加入100μl培养基，实验组与对照组加入密度为5.0×104cells/ml的RAW264.7细胞，每孔90μL；在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24h后，对照组每孔加入10μl培养基，实验组中加入10μl LPS溶液；在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24h，每孔加20μLMTS孵育2小时，酶标仪振荡10s，在490nm处测定吸光度值；
(2)设置细胞对照组和实验组，将细胞浓度调节为5×105个/ml，每孔1.8ml接种于24孔板中，对照组加入200μl细胞培养液，实验组分别加入200μl LPS溶液，在37℃，5％CO 2条件下培养24h；收集细胞上清液，用于测定炎症细胞因子的相关指标。
4.根据权利要求3所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述实验组LPS浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。
5.根据权利要求3所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述LPS与细胞作用时间为16h。
6.根据权利要求3所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述收集细胞上清液时间为培养后第4h、8h、16h、24h。
7.根据权利要求2所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述相关指标包括NO，TNF -α，IL -6和IL -1β。
权 利 要 求 书1/1页CN 108486056 A
一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种免疫细胞炎症模型的建立方法。特别涉及一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法。
背景技术
[0002]炎症反应是伴随多种疾病状态的一种共有的病理现象，在有血管分布的组织或细胞在应对损伤性刺激时，通过释放炎性介质所发生的防御反应，具有杀灭病原体，限制感染和修复损伤等作用。炎症反应通常需要精确调控，反应紊乱会造成组织损伤危害机体，严重时可危及生命。炎症疾病具有易反复，难治愈等特点，因此建立炎症模型对炎症药物的筛选和炎症性疾病的有实际意义。
[0003]目前的炎症实验模型主要有分子水平，动物水平与细胞水平。分子水平靶向性明确但无法对生物活性进行评价；动物模型可以用于研究炎症的机制但成本较高，周期长。细胞炎症模型与动物与分子水平相比成本低且周期短易操作，能明确反映炎症发生的过程。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种内毒素，组织或细胞感染后作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞(APC)捕获从而引起机体的免疫反应。巨噬细胞是参加炎症反应的中心细胞，具有吞噬，分泌和抗原呈递等作用，是炎症细胞因子的主要来源。因此，建立细胞水平上的炎症模型对研究炎症的发生机制和开发抗炎制剂具有重大的意义。
发明内容
[0004]本发明需要解决的技术问题是提供一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，为深入研究炎症的感染机制和筛选抗炎制剂提供技术基础和理论参考。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，采用LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度是1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。[0006]所述LPS浓度是100ng/ml，感染时间为16h。
[0007]上述LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，包括以下步骤：
[0008]设置空白组、对照组和实验组。在96孔板中空白组加入100μl培养基，实验组与对照组加入密度为5.0×104cells/ml的RAW264.7细胞，每孔90μL。在37℃，5％CO2培养箱中孵育24h后，对照组每孔加入10μl培养基，实验组中加入10μl LPS溶液。在37℃，5％CO2培养箱中孵育24h，每孔加20μLMTS孵育2小时，酶标仪振荡10s，在490nm处测定吸光度值。[0009]设置细胞对照组和实验组，将细胞浓度调节为5×105个/ml，每孔1.8ml接种于24孔板中，对照组加入200μl细胞培养液，实验组分别加入200μl LPS溶液，在37℃，5％CO2条件下培养24h。
[0010]收集细胞上清液，用于测定炎症细胞因子的相关指标。
[0011]实验组中LPS浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。
[0012]在培养后第4h，8h，16h，24h收集细胞上清液。
[0013]相关指标包括NO，TNF-α，IL-6和IL-1β。
[0014]为了研究LPS诱导RAW264.7细胞与炎症反应之间的关系和筛选抗炎药物，发明人以RAW264.7细胞为研究对象，建立了一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的方法，采用LPS 体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度为1-1000ng/ml，培养时间为4-24h。应用本发明，利用不同浓度LPS作用RAW264.7细胞不同时间，通过检测NO释放，细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌情况为指标，确定建立LPS诱
导RAW264.7细胞炎症模型的最佳时间和浓度，为探究细胞炎症与免疫之间的关系和免疫疾病的发生机制提供了理论依据，同时为后续筛选用于炎症感染的制剂的提供技术基础和理论参考。
附图说明
[0015]图1是LPS对RAW264.7细胞存活率的影响图。
[0016]图2是LPS体外处理对RAW264.7细胞NO分泌水平的影响图。
[0017]图3是LPS体外处理对RAW264.7细胞TNF-α分泌含量的影响图。
[0018]图4是LPS体外处理对RAW264.7细胞IL-6分泌含量的影响图。
[0019]图5是LPS体外处理对RAW264.7细胞IL-1β分泌含量的影响图。
具体实施方式
[0020]一、研究思路
[0021]本发明通过LPS体外刺激RAW264.7细胞，测定细胞分泌一氧化氮(NO)的水平，细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，白细胞介素6(IL-6)含量，白细胞介素1β(IL-1β)含量，探究LPS体外诱导RAW264.
7细胞与炎症之间的关系，建立RAW264.7细胞炎症模型。
[0022]二、实验方法
[0023](1)设置空白组、对照组和实验组。将密度为5.0×104cells/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板各孔中，每孔90μL。空白组加入100μl培养基，在37℃，5％CO2培养箱中孵育24h 后，然后在对照组每孔加入10μl培养基，实验组中加入10μl LPS溶液，终浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。在37℃，5％CO2培养箱中孵育24h后，每孔加20μLMTS孵育2小时，酶标仪振荡10s，在490nm处测定吸光度值。
[0024](2)设置细胞对照组与实验组，实验组浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ ml，将浓度为5×105的RAW264.7细胞接种于6孔板中，每孔1.8ml。对照组加入200μl细胞培养液，实验组分别加入200μl不同浓度的LPS溶液使LPS终浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ ml，1000ng/ml，在37℃，5％CO2条件下培养24h。
[0025](3)在培养第4h，8h，16h，24h收集细胞上清液，测定细胞中炎症介质的相关指标(一氧化氮含量、肿瘤坏死因子、白细胞介素6、白细胞介素1β)；MTS法检测细胞存活率，Griess法检测NO水平，ELISA法检测TNF-α，IL-6和IL-1β分泌水平。
[0026](4)实验数据以平均值±标准差(mean±SD，n＝3)表示，并进行单因素方差分析，运用SPSS19.0软件在P0.05水平上进行显著性分析。
[0027]三、实验结果
[0028]1、LPS对RAW264.7细胞存活率的影响
[0029]LPS对RAW264.7细胞存活率的影响如图1所示，随着LPS浓度升高，细胞存活率逐渐降低。1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml的LPS处理细胞，存活率分别为94.45％，
92.24％，88.77％，72.54％，LPS浓度为1000ng/ml时对细胞抑制作用最明显，与对照组相比差异显著(p<0.05)，1-100ng/ml的LPS处理细胞存活率较高，可以用于后续造模实验。[0030]2、LPS对RAW264.7细胞NO分泌的影响
[0031]LPS对RAW264.7细胞NO分泌结果如图2所示，不同浓度的LPS均能降低细胞中NO的分泌水平。与对照组相比，1ng/ml的LPS对RAW264.7细胞NO分泌影响不显著，10ng/ml的LPS 在4h，8h，16h显著提高了NO的分泌(p<0.05)，100ng/ml的LPS在4h，8h显著提高了NO的分泌(p<0.05)，在16h，24h极显著提高了NO的分泌(p<0.01)，1000ng/ml LPS在8h，16h，24h均显著提高了NO的分泌(p<0.05)。
[0032]3、LPS对RAW264.7细胞TNF-α分泌的影响
[0033]LPS对RAW264.7细胞TNF-α分泌结果如图2所示。随着浓度的提高，TNF-α分泌量逐渐增加，呈现浓度依赖性。与对照组相比，LPS浓度为1ng/m时RAW264.7细胞TNF-α分泌影响不显著，10ng/ml的LPS在8h，24h显著提高了TNF-α的分泌(p<0.05)。在LPS处理浓度为100ng/ml和1000ng/ml时，RAW264.7细胞分泌TNF-α的含量在各时间段均表现出极显著的提高(p<0.01)。
[0034]4、LPS对RAW264.7细胞IL-6分泌的影响
[0035]LPS对RAW264.7细胞IL-6分泌结果如图4所示。10ng/ml的LPS处理4h，8h，16h显著提高了IL-6的分泌(p<0.05)。100ng/ml的LPS处理4h显著提高了IL-6的分泌(p<0.05)，处理8h，16h，24h极显著提高了IL-6的分泌(p<0.01)。1000ng/ml的LPS处理4h显著提高了IL-6的分泌(p<0.05)，处理8h，16h可以极显著的提高IL-6的分泌水平(p<0.01)。
[0036]5、LPS对RAW264.7细胞IL-1β分泌的影响
[0037]LPS对RAW264.7细胞IL-1β分泌结果如图5所示。与对照组相比较，1ng/ml的LPS在处理24h时能显著提高IL-1β的分泌(p<0.05)，10ng/ml的LPS在处理16h时显著提高IL-1β的分泌(p<0.05)，1000ng/ml的LPS在处理8h与24h显著提高IL-1β的分泌(p<0.05)，在16h极显著提高了IL-1β的分泌含量(p<0.01)。100ng/ml的LPS在处理16h与24h均极显著提高IL-1β的分泌(p<0.01)。
[0038]四、研究结论
[0039]从实验结果可知，随着LPS浓度的增加和处理时间的延长，RAW264.7细胞中NO含量逐渐增加，TNF-α，IL-6和IL-1β细胞因子的分泌水平逐渐升高，细胞存活率逐渐下降。在LPS 处理浓度为100ng/ml，处理时间16h条件下，细胞NO的分泌显著高于对照组(P<0.01)，细胞分泌TNF-α，IL-6，IL-1β的水平显著高于对照组(P<0.01)，且在该处理条件下RAW264.7细胞存活率较高(88.77％)，因此，选择LPS处理浓度为100ng/ml，处理时间16h为建立RAW264.7细胞炎症模型的最佳条件。
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