(10)申请公布号 CN 102443057 A
(43)申请公布日 2012.05.09C N 102443057 A
*CN102443057A*
(21)申请号 201110327865.5
(22)申请日 2011.10.26
CGMCC No.5021 2011.06.29
C07K 14/78(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
C12P 21/02(2006.01)C12R 1/84(2006.01)
(71)申请人南京理工大学
地址210094 江苏省南京市孝陵卫200号
(72)发明人杨树林 刘斌 高立虎 李冰
雷云霆 张静 胡利 唐启伟
(74)专利代理机构南京理工大学专利中心
32203
代理人
唐代盛
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种重组人源胶原蛋白，氨基
酸序列如SEQNO.3，其含有599个氨基酸，分子量
为55.0kDa 。其制备方法为：表达重组人源胶原蛋
白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工
程菌；对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人
源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原
蛋白的发酵液；从发酵液中纯化重组人源胶原蛋
白。本发明设计的人源胶原蛋白基因Ge1是全新
的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因
(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易
实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；该人源胶
原蛋白基因Ge1同时包含天然人胶原蛋白基因的
特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优
良特征。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 7 页序列表 5 页 附图 4 页
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa 。
2.一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其特 征在于步骤如下：
（1）表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；
（2）对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；
（3）从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建如下：
1) 基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y 的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，其核苷酸序列如SEQ NO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；
2) 将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 5021。
4.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于基因工程菌的培养基为：
1) 种子培养基：100mM 磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB ，4×10-5％生物素，1％甘油(V/V)；
2) 分批发酵培养基：85% H 3PO 4 26.7ml/L ；CaSO 4 0.93g/L ；K 2SO 4 18.2g/L ；MgSO 4·7H 2O 14.9g/L ；KOH 4.13g/L ；甘油 40.0g/L ，灭菌后再加入PTM 1微量元素；其中PTM 1微量元素：CuSO 4·5H 2O 6.0g/L ；NaI 0.08g/L ；MnSO 4·H 2O 3.0g/L ；NaMoO 4·2H 2O 0.2g/L ；H 3BO 3 0.02g/L ；CoCl 2 0.5g/L ；ZnCl 2 20.0g/L ；FeSO 4·7H 2O 65.0g/L ；生物素 0.2g/L ；H 2SO 4 5.0ml/L ，用0.22μm 的滤膜过滤除菌，室温保存；
3) 补料生长培养基：50%(W/V)甘油，每升含12mL 的PTM 1微量元素；
4) 发酵诱导培养基：100%甲醇，每升含12mL 的PTM 1微量元素。
5.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于基因工程菌的发酵培养条件及重组人源胶原蛋白诱导表达条件为：
采用分批-补料培养方法，培养温度28℃，pH5.0，即1）将种子培养基培养的菌种按10%接种量加入含分批发酵培养基发酵罐中开始培养，调节搅拌转速为500 r/min -800 r/min 、罐压为0.2-1.0bar 、空气流量为200 In/h -300 In/h ，使溶氧>30%；2）当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基，流加速率为维持溶氧>20%，至菌体湿重达180~220g/L ，停止补加甘油；3）甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧>20%，诱导发酵96-120h 后，结束发酵，收集发酵液。
6.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于重组人源胶原蛋白的提取纯化如下：对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。
一种重组人源胶原蛋白及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是一种高亲水性重组人源胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
[0002] 胶原蛋白(也称胶原)是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族。胶原蛋白具有很强的生物活性
及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖，使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性和生物降解性能。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、保健、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛的应用。另外，胶原蛋白也可作为食品添加剂、饲料添加剂、絮凝剂、照相乳胶材料、表面活性剂和固定化酶载体材料等应用于各个工业和实验室领域。
[0003] 目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)，从中提取胶原蛋白。但所得到的产品成分复杂，主要应用于饲料添加及微生物发酵培养基。四川铭让生物科技有限公司采用生物酶定向剪切技术，生产的胶原蛋白组成稳定，具有生物活性。但以上这些方法得到的胶原蛋白产品都有一定的病毒隐患(如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫、禽流感等)，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。
[0004] 随着DNA重组技术迅速发展，为了能充分利用胶原蛋白的优良特性，科研工作者开始寻求动物本身以外的胶原蛋白来源。有许多学者利用基因工程技术．选用各种宿主细胞(包括：哺乳动物、昆虫、酵母、大肠杆菌、转基因烟草、转基因鼠、转基因蚕细胞等)，生产重组人胶原蛋白，产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点。但是，同样存在着许多不足和困难。例如日本广岛大学的Tomita利用转基因蚕的绢丝腺分泌生产人胶原蛋白，生产的人胶原蛋白长度仅有真正的人胶原蛋白全长的1/5，且含量只有1%左右。总体来说，表达量不高、生产周期长和培养难度大、成本高是以高等
动植物细胞为宿主时普遍存在的问题，且不能满足产业化、大批量生产的要求。国内有利用大肠杆菌生产类人胶原蛋白的报道（一种类人胶原蛋白及其生产方法，发明人：范代娣，公开号：CN 1371919A，公开日：2002年10月2日，中华人民共和国国家知识产权局）。而细菌表达系统普遍存在产生致热原使表达产物难以应用于临床，蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难，及其原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等不足。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用巴氏毕赤酵母进行表达的重组人源胶原蛋白，其具有优于动物体胶原蛋白的独特的化学结构和性能，同时提供该重组人源胶原蛋白的制备方法。
[0006] 实现本发明目的的技术解决方案为：一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ
NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。
[0007] 一种重组人源胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
（1）表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；
（2）对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；
（3）从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。
[0008] 本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)设计的人源胶原蛋白基因Ge1是全新的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；(2)该人源胶原蛋白基因Ge1同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征；(3)在人源胶原蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的酵母表达研究中实现接近较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；(4)该种不同重复数同向串联基因重组质粒的制备方法，仅仅通过简单的体外酶切连接反应和具有成熟技术的原核转化和筛选，实现了任意重复数的目的基因(重组人源胶原蛋白基因Ge1)的串联连接；(5)该法比较现有的许多应用PCR技术实现重复更具有可行性和更易获得成功．避免了达到重复串联目的基因的PCR操作中需要的高难度的引物设计和条件探索工作；(6) 可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞内和胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等。
[0009] 下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
[0010] 图1是重组人源胶原蛋白的SDS-PAGE检测。
[0011] 图2是纯化过程中的凝胶过滤层析图谱。
[0012] 图3是纯化效果验证用凝胶过滤层析图谱。
[0013] 图4是重组人源胶原蛋白的质谱分析。
[0014] 图5是重组人源胶原蛋白的紫外光谱。
[0015] 图6是重组人源胶原蛋白的红外光谱。
[0016] 图7是重组人源胶原蛋白的扫描电镜。
[0017] 图8是重组人源胶原蛋白海绵促NIH3T3细胞生长趋势（横坐标浓度为相对浓度。）。
具体实施方式
[0018] 本发明的重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。
[0019] 上述重组人源胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌，其巴氏毕赤酵母基因工程菌的构建如下：
1)基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y(甘氨酸-X-Y)的三肽重复序列特征，设
计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体Gel，其核苷酸序列如SEQNO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；
2)将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.5021。分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位的地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。[0020] 上述巴氏毕赤酵母基因工程菌的构建具体过程如下。
[0021] ①设计重组人源胶原蛋白基因单体(Ge1)
其碱基序列如图1（SEQ NO.1）。其核酸长度为322bp，命名为Ge1。该单体克隆在质粒pUC57的SmaI位点，得到的重组质粒命名为pUC57Gel。选择的一对同尾酶为Dra III和Van91I，位于重组人源
胶原蛋白基因单体(Ge1)的两端。设计接头Al和A2，其中Al含有的酶切位点为Eco RI和Dra III，A2含有的酶切位点为Not I和Van91I。选择的表达质粒为pPIC9K。
[0022] ②将用一对同尾酶酶切得到的目的基因单体进行体外连接
将重组质粒pUC57Gel采用CaCl
法转化大肠杆菌DH5α，经过含Amp的LB平板
2
筛选得到含有质粒pUC57Gel的重组大肠杆菌，命名为DH5α／pUC57Gel。液体LB培养基过夜培养DH5α／pUC57Gel。提取质粒，得到大量的pUC57Gel。以一对同尾酶Dra III和Van9lI双酶切质粒pUC57Gel，电泳回收约300bp的小片段，获得大量人源胶原蛋白基因单体，将这部分人源胶原蛋白基因单体用T4DNA连接酶进行连接，4℃过夜，得到含有不同重复数胶原蛋白基因单体的连接体。
[0023] ③利用接头将步骤2得到的连接产物，直接连入已含有目的基因单体的质粒．获得重复数较少的重组质粒
将步骤2得到连接产物加入到含有pUC57Gel的Eco RI／Dra III双酶切后电泳回收得到的大片段和Eco RI酶切回收的复性接头Al的连接体系中，4℃过夜连接。连接产物采用CaCl
法转化大肠杆菌Topl0F’，经过含Amp的LB平板筛选阳性克隆，经过提取筛选到
2
的阳性克隆的质粒并进行酶切电泳检验含有质粒的长度判断得到的重组大肠杆菌所含有的质粒中包含类人胶原蛋白基因单体的重复数，主要出现包含有2、3、4重复数的重组质粒的大肠杆菌。将含有重复数为3的质粒定名为pUC57A1G3，含有该pUC57A1G3质粒的重组大肠杆菌命名为Top10F’／pUC57A1G3。
[0024] ④将重复数较少的质粒进行重复数翻倍的连接，获得含有目的基因的重复数较高的重组质粒
液体LB培养基过夜培养Top10F’／pUC57A1G3，提取质粒，得大量的pUC57A1G3。以限制性内切酶Eco RI和Van9lI双酶切质粒pUC57A1G3，电泳回收约900bp的小片段，获得大量人源胶原蛋白基因三联体DNA片段。另外以限制性内切酶Eco RI和Dra III双酶切质粒pUC57A1G3，电泳回收大片段，得到含有3重复人源胶原蛋白基因单体的A1G3质粒大片段。
将上述回收得到的两种片断用T4DNA连接酶连接，4℃过夜，得到的连接产物直接采用CaCl
2法转化大肠杆菌Top10F’，经过含Amp的LB平扳筛选得到含有pUC57A1G6(含有6个人源胶
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