(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710402152.8
(22)申请日 2017.06.01
(71)申请人 新疆农垦科学院
地址 832000 新疆维吾尔自治区石河子市
农科院小区
(72)发明人 叶春秀 于航 赵曾强 马盼盼
田又升 谢宗铭
(74)专利代理机构 北京汇众通达知识产权代理
事务所(普通合伙) 11622
代理人 梁明升
(51)Int.Cl.
C12N 9/22(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种采用蛋白质提取试剂盒
快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，包括步骤
1，在1mL蛋白提取裂解液中加入适量蛋白酶抑制
剂和PMSF；步骤2，取100mg新鲜芹菜嫩叶或茎秆
组织放入研钵中，并在液氮环境中碾碎；步骤3，
将碾碎后的芹菜嫩叶或茎秆组织，加入步骤1混
合而成的裂解液中，在4℃温度条件下裂解20-
30min；步骤4，在4℃温度条件下，rpm10000，离心
30min，吸取上清液，即得CEL I酶粗提液。本发明
提取过程操作简单，2h即可获得相应的蛋白酶产
物；接触有害物质的时间较大程度缩短，安全性
增加。权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 106967698 A 2017.07.21
C N 106967698
A
1.一种采用蛋白质提取试剂盒快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在1mL蛋白提取裂解液中加入适量蛋白酶抑制剂和PMSF；
步骤2：取100mg新鲜芹菜嫩叶或茎秆组织放入研钵中，并在液氮环境中碾碎；
步骤3：将碾碎后的芹菜嫩叶或茎秆组织，加入步骤1混合而成的裂解液中，在4℃温度条件下裂解20-30min；
步骤4：在4℃温度条件下，rpm10000，离心30min，吸取上清液，即得CEL I酶粗提液。
2.根据权利要求1所述的快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂和所述PMSF添加量均为10μL。
3.根据权利要求1所述的快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，裂解过程中每隔5min震荡1次。
权 利 要 求 书1/1页CN 106967698 A
一种快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法
[0001]本发明涉及活性酶提取技术领域，特别是一种采用蛋白质提取试剂盒快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法。
背景技术
[0002]TILLING技术(即定向诱导基因组局部突变技术)是近些年发展起来的一项新技术，已在一些主要作物种质创新过程中得到了广泛的应用，获得了许多有益的育种资源。TILLING技术主要是采用化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)等处理种子或组织器官来构建诱变体，对诱变体进行基因组DNA提取后，将多个样品DNA混合并进行PCR扩增得到异源双链，利用CEL I等特异性核酸内切酶对变异位点切割，最后电泳检测酶切片段，鉴定出变异位点，从而筛选对应的变异植株。CEL I酶作为TILLING技术的关键酶，可有效识别并切割异源双链中的碱基错配，对变异植株的鉴定具有重要意义。CEL I酶虽已商品化，但价格昂贵，难以大规模的应用于科研中，国内外虽已有关于芹菜CEL I酶提取方法的报道， 但操作过程较繁琐，耗时长，因此，建立一种快速提取CEL I酶的方法对开展相关实验具有重要的意义。[0003]现有技术中，芹菜CEL I酶的提取方法主要有Yang、Till、韩锁义等的方法，这几种提取芹菜CEL I酶的方法，存在以下缺陷：1.提取过程较繁琐，耗时较长；2.试剂使用较多，费用相对昂贵；3.接触有毒物质时间较长，安全性存在隐患。
发明内容
[0004]针对上述问题，本发明提供了一种采用蛋白质提取试剂盒快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法。
[0005]一种采用蛋白质提取试剂盒快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，包括以下步骤：[0006]步骤1：在1mL蛋白提取裂解液中加入适量蛋白酶抑制剂和PMSF；
[0007]步骤2：取100mg新鲜芹菜嫩叶或茎秆组织放入研钵中，并在液氮环境中碾碎；[0008]步骤3：将碾碎后的芹菜嫩叶或茎秆组织，加入步骤1混合而成的裂解液中，在4℃温度条件下裂解20-30min；
[0009]步骤4：在4℃温度条件下，rpm10000，离心30min，吸取上清液，即得CEL I酶粗提液。
[0010]进一步的，所述蛋白酶抑制剂和所述PMSF添加量均为10μL。
[0011]进一步的，裂解过程中每隔5min震荡1次。
[0012]本发明提取过程操作简单，2h即可获得相应的蛋白酶产物；接触有害物质的时间较大程度缩短，安全性增加。
附图说明
[0013]图1为CEL I酶提取的SDS-PAGE考马斯亮蓝染图；
[0014]图2为CEL I酶与SURVEYOR酶活性对比检测图。
具体实施方式
[0015]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0016]实施例1
[0017]一种采用蛋白质提取试剂盒快速提取芹菜CEL I酶粗提液的方法，包括以下步骤：[0018]步骤1：在1mL蛋白提取裂解液中加入10μL蛋白酶抑制剂和10μLPMSF；
[0019]步骤2：取100mg新鲜芹菜嫩叶或茎秆组织放入研钵中，并在液氮环境中碾碎；[0020]步骤3：将碾碎后的芹菜嫩叶或茎秆组织，加入步骤1混合而成的裂解液中，在4℃温度条件下裂解20-30min，期间每隔5min震荡1次；
[0021]步骤4：在4℃温度条件下，rpm10000，离心30min，吸取上清液，即得CEL I酶粗提液。
[0022]本发明提取过程操作简单，2h即可获得相应的蛋白酶产物，如图1所示；接触有害物质的时间较大程度缩短，安全性增加，现有提取方法在操作过程中接触PMSF的时间达到12h左右，而本实施例采用的方法接触PMSF时间仅仅在最开始加入PMSF的几秒时间。[0023]下面以标准酶SURVEYOR Mutation Detection Kit Components为对照，用提取的CEL I酶对扩增的Control C和Control G异质双链DNA分子进行酶切，比较通过本实施例提取处的CEL I酶粗提液与SURVEYOR酶的酶切效果，验证提取方法的可靠性。
[0024]一、对SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中的Control C和Control G(with primers)在最佳退火温度下进行PCR扩增，50μL PCR体系见下表1，PCR扩增程序见下表2。
[0025]
[0026]
[0027]表1
[0028]
[0029]表2
[0030]二、取4μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确保扩增产物单一且浓度适宜后进行异质双链的合成，分别取Control C和Control G(with primers)的PCR扩增产物各10μL，经过表3所示的PCR扩增程序，获得碱基错配的异质双链DNA分子。
[0031]
Step199℃2min
Step299℃-72℃(-0.7℃/sec)
Step372℃-25℃(-0.3℃/sec)
Step44℃forend
[0032]表3
[0033]三、以SURVEYOR酶为对照，用本实施例提取的CEL I酶粗提液对异质双链产物进行酶切，酶切温度45℃，酶切时间40min，酶切体系为10μL异质双链DNA分子+8μL ddH2O+2μL SURVEYOR/CEL I酶粗提液。
[0034]四、酶切结束后，加入2μL的6×loading Buffer在2％的琼脂糖凝胶电泳上进行酶切效果检测，比较分析本实施例提取的CEL I酶粗提液与SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中SURVEYOR酶的酶切效果，图2为CEL I酶与SURVEYOR酶活性对比检测图，对比可以看出，两种酶的酶切效果一样，说明本实施例提取的CEL I酶可以用于TILLING技术中异质双链的酶切分析。
[0035]最后，还需要注意的是，以上列举仅是本发明一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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