(10)申请公布号 CN 102260721 A
(43)申请公布日 2011.11.30C N 102260721 A
*CN102260721A*
(21)申请号 201010187180.0
(22)申请日 2010.05.31
C12P 13/02(2006.01)
(71)申请人尚科生物医药（上海）有限公司
地址201319 上海市浦东新区横沔镇叠桥路
128号
(72)发明人祝俊 陶军华 苏金环 孙勇
黄悦 金志平 谢作念 陈见阳
(74)专利代理机构浙江翔隆专利事务所 33206
代理人张建青
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种用酶法制备(S)-2-氨基
丁酰胺的合成工艺。目前的制备方法存在成本较
高，收率偏低，环境隐患大等问题。本发明采用的
技术方案为：以2-氨基为起始原料，通过酶
催化在缓冲溶液体系中一步制备(S)-2-氨基丁
酰胺。本发明在主要过程中都是以水作为溶剂，无
需使用大量对环境有害的有机溶剂，整个工艺成
本较低，有利于大批量的工业制备。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 3 页
1.一种用酶法制备(S)-2-氨基丁酰胺的方法，其特征在于：以2-氨基为起始原料，通过腈水合酶催化，在缓冲溶液体系中一步制备(S)-2-氨基丁酰胺；所述的缓冲溶液pH值为6.0～8.0，腈水合酶与2-氨基的质量比为1∶100-1∶10，反应温度为15～40℃，反应时间为3～24小时。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的腈水合酶为经细胞破碎、分离得到的粗酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的腈水合酶选用ES-NHT-105、ES-NHT-107或ES-NHT-120，所述的酶通过E.coli克隆表达得到，并通过发酵大量制备。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲溶液pH值为6.5～7.2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的缓冲溶液为磷酸氢钠和磷酸二氢钠缓冲溶液体系。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于腈水合酶与2-氨基的质量比为1∶50-1∶30。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反应温度为15～25℃，反应时间为15-24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于腈水合酶反应过程中剩余的另一构型底物(R)-2-氨基通过动力学拆分或者在碱性条件下消旋后回收利用。
一种用酶法制备（S）-2-氨基丁酰胺的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物中间体合成领域，具体地说是一种合成左乙拉西坦的关键中间体(S)-2-氨基丁酰胺的制备方法。
技术背景
[0002] 左乙拉西坦是一种新型抗癫痫药，是由比利时UCB公司开发的结构与吡拉西坦相关的第二代乙酰胆碱激动剂，主要用于局限性及继发性全身性癫痫。其化学名为：(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，结构式如下：
[0003]
[0004] 目前的左乙拉西坦合成工艺中，大多通过(S)-2-氨基丁酸或者(S)-2-氨基丁酰胺两个中间体制备左乙拉西坦，尤其是通过(S)-2-氨基丁酰胺制备左乙拉西坦是目前工业化生产的主要工艺，该工艺制备所得的左乙拉西坦成本低、质量优异，因此(S)-2-氨基丁酰胺已成为生产左乙拉西坦的关键中间体。
[0005] 从文献报道和工业化应用中我们发现(S)-2-氨基丁酰胺的制备方法大致可分为两类：拆分和不对称合成。拆分过程一股采用谱分离技术，例如，US6107492和WO 2003/104480；或者采用化学拆分试剂进行拆分，例如，US4943639，WO 2006/053441，CN 1583721和WO 2006/103696就分别采用了胺类和酸类拆分试剂。此系列方法收率较低，并且需要加入过量有毒有害有机试剂，存在环境隐患。
[0006] 不对称合成方法需要在制备过程中产生一个不对称中心，例如，US 6713635，WO 2001/064637，WO 2003/104480和CN1651410分别采用手性催化剂形成了不同类型的药物中间体；或者在起始原料中直接引入手性中心，例如，WO 2005/028435，US 2005/0182262，WO 2006/095362，WO 2006/1127300，WO2006/090265分别以手性氨基酰胺、手性氨基酸、手性氨基醇、手性羰基酸和手性氨基酯为起始物。这些方法虽然收率较高，但是使用的起始原料和试剂价格昂贵，并且同样使用大量有毒害有机溶剂，而且需要多个合成步骤。[0007] 目前的制备方法成本较高，收率偏低，环境隐患大，工艺条件也不适合工业放大，因此建立一个高效、低成本，且易于工业化大生产的(S)-2-氨基丁酰胺制备工艺仍是值得探索的领域，在制药工业上也有较好的应用前景。
发明内容
[0008] 本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种高效、低成本、绿环保且易于工业化大生产的(S)-2-氨基丁酰胺的制备方法。
[0009] 为此，本发明采用的技术方案为：一种用酶法制备(S)-2-氨基丁酰胺的方法，其特征在于：以2-氨基为起始原料，通过腈水合酶催化，在缓冲溶液体系中一步制备(S)-2-氨基丁酰胺；所述的缓冲溶液pH值为6.0～8.0，优选为6.5～7.2；腈水合酶与2-氨基的质量比为1∶100-1∶10，优选为1∶50-1∶30；反应温度为15～40℃，优选为15～25℃；反应时间为3～24小时，优选为15-24小时。
[0010] 本发明所使用的腈水合酶通过E.coli克隆表达得到，可通过发酵大量制备，是相对易得和廉价的催化剂。所述的酶为经细胞破碎、分离得到的粗酶制剂，优选ES-NHT-105、ES-NHT-107或ES-NHT-120(尚科生物医药(上海)有限公司的市售产品)，其中ES-NHT-105来源于Bradyrhizobiumjaponicum USDA 110JCM10833；ES-NHT-107来源于Stappia aggregata JCM 20685；ES-NHT-120来源于Aurantimonas sp.5185-9A1 ATCC BAA-1229。[0011] 本发明的有益效果是：1)在主要过程中都是以水作为溶剂，无需使用大量对环境有害的有机溶剂，绿环保；而且以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂，以结晶的方式进行终产物分离，这些特点使整个工艺成本较低，有利于大批量的工业制备；2)腈水合酶反应过程中剩余的另一构型底物，即(R)-2-氨基可以通过动力学拆分或者在碱性条件下
消旋后回收利用，从而大大提高了产率，降低了成本。3)用本发明所得的(S)-2-氨基丁酰胺制备左乙拉西坦，最终产品的纯度可达到99％以上，光学纯度＞98％，宜于工业化。[0012] 下面将通过实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述，其目的是为更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
具体实施方式
[0013] 实施例12-氨基2的合成
[0014] 在100毫升三颈瓶中，加入8.45克(1.3当量)，25％的氨水40毫升，然后再加入7.87克氯化铵(1.5摩尔)，搅拌下溶解。滴加5.8克(0.1摩尔)正丙醛(化合物1)，控温10-25℃，搅拌过夜，用二氯甲烷提取三次。合并有机提取液，用20毫升饱和食盐水洗涤，加入10克无水硫酸镁干燥。过滤，在30℃水浴中，通过旋转蒸发减压除去二氯甲烷，得2-氨基约6.7克，呈浅黄油状液体，收率为79.8％。
[0015] 实施例2腈水合酶的筛选
[0016] 将实施例1所得的2-氨基配制成10克/升的溶液，在平行反应容器中分别
加入5毫克NHT-101～NHT-124共24种腈水合酶，加入0.45毫升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/
NaH
2PO
4
，0.1M，pH 7.2)，再分别加入0.05毫升α-氨基溶液，室温下震荡过夜，LC-MS
检测反应，结果有13个酶可反应生成产物。对这13个酶进行选择性比较，控制反应时间，使其反应转化率＜50％(C18柱；UV 200nm检测；流动相：20mM磷酸盐缓冲液(pH 3.0)/乙腈＝95/5，v/v)，其中3个酶(NHT-105，NHT-107和NHT-120)的对映体过量值(ee)＞80％(CR(+)柱；UV 200nm检测；流动相：高氯酸水溶液(pH 1.2))，分别用这三个酶进行(S)-2-氨基丁酰胺的制备。
[0017] 实施例3(S)-2-氨基丁酰胺的制备(ES-NHT-105)
[0018] 在25毫升三角瓶中依次加入50毫克2-氨基，1毫克腈水合酶NHT-105，及5
毫升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/NaH
2
PO
4
，0.1M，pH 7.2)，在30℃下160rpm旋转式摇床上反应
15小时后，取样进行HPLC分析，转化率为33％，ee值为82％。
[0019] 实施例4(S)-2-氨基丁酰胺的制备(ES-NHT-107)
[0020] 在25毫升三角瓶中依次加入50毫克2-氨基，1毫克腈水合酶NHT-107，及5
毫升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/NaH
2
PO
4
，0.1M，pH 7.2)，在30℃下160rpm旋转式摇床上反应
15小时后，取样进行HPLC分析，转化率为48％，ee值为81％。
[0021] 实施例5(S)-2-氨基丁酰胺的制备(ES-NHT-120)
[0022] 在25毫升三角瓶中依次加入50毫克2-氨基，1毫克腈水合酶NHT-120，及5
毫升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/NaH
2
PO
4
，0.1M，pH 7.2)，在30℃下160rpm旋转式摇床上反应
15小时后，取样进行HPLC分析，转化率为40％，ee值为85％。
[0023] 实施例6(S)-2-氨基丁酰胺的制备(ES-NHT-120)
[0024] 在25毫升三角瓶中依次加入250毫克2-氨基，5毫克腈水合酶NHT-120，及
5毫升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/NaH
2
PO
4
，0.1M，pH 6.5)，在25℃下160rpm旋转式摇床上反应
18小时后，取样进行HPLC分析，转化率为46％，ee值为85％。
[0025] 实施例7(S)-2-氨基丁酰胺盐酸盐的制备(ES-NHT-120)
[0026] 在50毫升三角瓶中依次加入3g2-氨基，30毫克腈水合酶NHT-120，及30毫
升磷酸盐缓冲液(Na
2HPO
4
/NaH
2
PO
4
，0.1M，pH 6.5)，在15℃下磁力搅拌反应24小时后，取样
进行HPLC分析，转化率为43％，ee值为89％。加入50毫升乙酸乙酯萃取，收集水层后加入
大量的乙腈，合并有机提取液，30℃水浴旋蒸除去溶剂，得到黄油状物，将其滴加到氯化氢异丙醇(
30％)中，搅拌均匀，得到白结晶。冷却，过滤，用20毫升异丙醇洗3次，得到(S)-2-氨基丁酰胺盐酸盐1.59克，收率75％。LC-MS：m/z 103(M+1)+，157(M+HCl+H2O+H)+，注M代表(S)-2-氨基丁酰胺分子量；1H NMR(D
2
O，400MHz)：δ.1.39(t，3H)，2.62(m，2H)，
5.38(t，1H)；13C-NMR(D
2
O，400MHz)：δ10.97，26.85，56.69，174.85。
[0027] 实施例8左乙拉西坦的合成
[0028] 氮气保护下加1.38克无水硫酸钠、氢氧化钾3.00克、20毫升工业级四氢呋喃，冰水浴冷却至0-5℃，投加(S)-2氨基丁酰胺盐酸盐(138克，0.01摩尔，实施例7制备所得，ee值为89％)，保温0～5℃反应60分钟。剧烈搅拌下，在15分钟内滴加完1.41克4-氯丁酰氯，温度保持在0～5℃，加毕，0℃左右反应4小时，补加氢氧化钾1.0克，继续0℃下搅拌反应4小时，过滤，30℃水浴旋蒸除去溶剂，加入
丙酮7毫升重结晶得目标产物1.23g，收率79％(ee值＞98％，ChiralpakAD-H；以正己烷-乙醇(80∶20)为流动相；
UV215nm)。LC-MS：m/z 157(M++1)；1H NMR(CDCl
3
，400MHz)：δ.5.24(m，1H)，4.25-4.29(m，1H)，4.10-4.14(m，1H)，2.29(t，2H)，1.58(s，1H)，0.86(m，5H)。
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