(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911292593.2
(22)申请日 2019.12.16
(71)申请人 南京工业大学
地址 211816 江苏省南京市江北新区浦珠
南路30号
(72)发明人 何冰芳 高兵兵 褚天舒 叶家捷
储建林 郭茂泽
(74)专利代理机构 江苏致邦律师事务所 32230
代理人 徐蓓 尹妍
(51)Int.Cl.
C12N 11/082(2020.01)
C12N 11/096(2020.01)
C12N 9/24(2006.01)
C12N 9/20(2006.01)
C12N 9/50(2006.01)
C12N 9/84(2006.01)B29C 64/10(2017.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了基于3D打印技术的酶固定化
酶固定化。载体支架制作成本低，在表面处理后
保持了良好的机械强度并拥有较高的比表面积，
形成固定化酶之后，具有较好的催化性能及重复
使用性。权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 110938618 A 2020.03.31
C N 110938618
A
1.一种基于3D打印技术的酶固定化方法，其特征在于，使用3D打印支架作为载体，经表面活性化处理后将酶与载体结合，并进行催化合成，实现酶固定化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将高分子材料通过3D打印成型获取所述3D 打印支架。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高分子材料选取C -PLA、PLA或ABS。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3D打印支架采用FDM技术打印成型。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体表面活性化处理的方法为：
1）使用食人鱼溶液进行刻蚀；以获得更大的比表面积；
2）通过过氧乙酸处理，向材料表面引入羟基基团；
3）添加硅烷偶联剂，引入与酶分子相结合的表面活性基团。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，反应温度为85℃。 7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，反应体系为：乙酸和30%过氧化氢按体积比1：1混合，加入浓硫酸和硫酸亚铁作为催化剂，反应温度为70℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，硅烷偶联剂选用环氧硅烷或氨基硅烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶为青霉素G酰化酶，糖苷酶，脂肪酶或蛋白酶；反应体系为固液体系。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶固定化温度为25℃，pH7.0。
权 利 要 求 书1/1页CN 110938618 A
基于3D打印技术的酶固定化方法
技术领域
[0001]本发明属于酶固定化领域，具体涉及一种基于3D打印技术的酶固定化方法。
背景技术
[0002]酶催化在于它们在食品，化学，制药和其他行业等多种领域的应用，促进了精细化学品，食品添加剂和药品的绿制造和可持续生产。然而，在工业应用中，游离酶催化反应在复杂的反应体系中容易失活，例如有机相，高浓度反应体系，高温，极端pH范围等。而且，游离酶不能长时间稳定地操作和再利用，并且酶难以与反应体系分离。酶可以与载体组合以完成酶的回收和再利用以增加稳定性。固定化酶可形成反应器以增加可操作性和持久性以达到连续反应的目的。但是由于载体过于昂贵，商业化的效果并不理想。许多固定化载体具有低蛋白质负载和固定化效率。纳米材料的研究提供了用于酶固定的高负载固定化材料，并且多功能固定化方法提高了酶的固定化效率。各种方法致力于提高固定效率，简化固定步骤，降低固定化成本，但目前可广泛应用的固定策略和载体是有限的。一般而言，具有良好可操作性，简单固定化步骤，低成本，各种酶的普遍应用和催化环境的方法或固定化载体仍然是发展的主流。
[0003]3D打印技术，又称增材制造。它已广泛应用于工业设计，建筑，组织工程等领域。3D 打印的主要优点是能够构建复杂的结构，尤其是具有复杂内部结构的封闭式外壳，多孔结构和具有多个弯曲的通道。3D打印的另一个优点是打印组件的形貌是可控的。只需修改基于计算机的技术图纸，即可对其进行全面修改或本地修改。复杂部件通常由几个简单的部件机械组装而成。为了精确组装，组件需要彼此特定且精确地对齐。传统的加工方法不适合于创建这种集成的复杂结构。除了更方便地实现某些复杂的3D几何形状的创建之外，3D打印还具有低成本和节省时间的优点。工程技术的进步和印刷设备的成本降低为3D打印提供了在实验室环境中创建功能设备的机会。已经使用诸如反应器，组织工程支架和检测器的3D打印件完成了许多工作。3D打印的组织支架允许细胞附着生长，如果打印的载体被修饰，则可以固定酶。目前，关于3D打印在固定化中的应用的研究很少。因此，3D打印在酶固定化中的应用具有良好的发展潜力。
发明内容
[0004]本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种基于3D打印技术的酶固定化方法。本发明材料价格低廉，制备方法简单，固定化酶催化性能和重复使用性能良好，具有很好的使用价值。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于3D打印技术的酶固定化方法，使用3D打印支架作为载体，经表面活性化处理后将酶与载体结
合，并进行催化合成，实现酶固定化。
[0006]进一步的，所述3D打印支架通过将高分子材料3D打印成型获取。所述材料选取应满足廉价易得，安全无毒，并具有一定机械强度，优选采用C-PLA、PLA、ABS等高分子材料。
[0007]进一步的，所述3D打印支架采用FDM技术打印成型。
[0008]进一步的，所述载体表面活性化处理的方法为：
1）使用食人鱼溶液进行刻蚀，以获得更大的比表面积；
2）通过过氧乙酸的进一步处理，向材料表面引入羟基基团；
3）添加硅烷偶联剂，引入与酶分子相结合的表面活性基团，使得酶分子可以通过共价结合固定在载体上。
[0009]进一步的，所述步骤1）中，反应温度为85℃。
[0010]进一步的，所述步骤2）中，反应体系为：乙酸和30%过氧化氢按体积比1：1混合，加入浓硫酸和硫酸亚铁作为催化剂，反应温度为70℃。
[0011]进一步的，所述步骤3）中，硅烷偶联剂主要为环氧硅烷，氨基硅烷等，用于提供与酶分子共价结合的活性基团。
[0012]进一步的，所述酶主要为青霉素G酰化酶，糖苷酶，脂肪酶，蛋白酶等，反应体系为固液体系。
[0013]进一步的，酶固定化温度为25℃，pH7.0。
[0014]与现有技术相比，本发明的方法获取的固定化酶结构可控，可根据反应器的不同进行灵活调整，同时材料价格低廉，制备方法简单，固定化酶催化性能和重复使用性能良好，具有很好的使用价值。
附图说明
[0015]图1为基于3D打印技术的酶固定化载体的制作示意图。
[0016]图2为使用固定化青霉素G酰化酶进行催化合成的反应进程曲线和重复使用性测定。
[0017]图3为使用固定化糖苷酶进行催化合成的反应进程曲线和重复使用性测定。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。[0019]实施例1
一种基于3D打印技术的青霉素G酰化酶固定化方法，包括以下步骤（图1）：
1）选用C-PLA材料作为支架材料，采用FDM技术3D打印成型，获取3D打印支架作为载体；
2）选用食人鱼溶液对载体进行修饰，以增大比表面积。食人鱼溶液最佳配比为浓硫酸和30%过氧化氢（v/v=1：1.4），在85℃条件下处理110分钟。随后将载体清洗并烘干。[0020]3）使用过氧乙酸对上述载体进行进一步处理，以引入羟基基团。反应体系为：乙酸和30%过氧化氢（v/v=1），加入少量浓硫酸和硫酸亚铁作为催化剂，于70℃下反应1小时。随后将载体清洗并烘干。
[0021]4）将上述载体置于硅烷偶联剂溶液中进行处理，反应溶液体积为10mL，选用硅烷偶联剂KH550，硅烷偶联剂浓度为5%，反应时间1h，反应温度25℃。反应结束后用去离子水洗涤3次，用3%的戊二醛溶液处理2小时。随后将载体清洗并烘干。
[0022]5）使用青霉素G酰化酶粗酶液对上述步骤修饰后的载体进行固定化，固定时间
10h，固定化温度25℃，固定pH 7.0。
[0023]6）将上述所得固定化酶用于阿莫西林合成，并测定重复使用性，结果如图2所示，固定化酶催化性能和重复使用性能良好。
[0024]实施例2
一种基于3D打印技术的糖苷酶固定化方法，包括以下步骤：
1）选用C-PLA材料作为支架材料，采用FDM技术3D打印成型，获取3D打印支架作为载体；
2）选用食人鱼溶液对载体进行修饰，以增大比表面积。食人鱼溶液最佳配比为浓硫酸和30%过氧化氢（v/v=1：1.4），在85℃条件下处理110分钟。随后将载体清洗并烘干。[0025]3）使用过氧乙酸对上述载体进行进一步处理，以引入羟基基团。反应体系为：乙酸和30%过氧化氢（v/v=1），加入少量浓硫酸和硫酸亚铁作为催化剂，于70℃下反应1小时。随后将载体清洗并烘干。
[0026]4）将上述载体置于硅烷偶联剂溶液中进行处理，反应溶液体积为10mL，选用硅烷偶联剂KH560，硅烷偶联剂浓度为5%，反应时间1h，反应温度25℃。反应结束后用去离子水洗涤3次。随后将载体清洗并烘干。
[0027]5）使用糖苷酶粗酶液对上述步骤修饰后的载体进行固定化，固定时间10h，固定化温度25℃，固定pH 7.0。
[0028]6）将上述所得固定化酶用于乳果糖合成，并测定重复使用性，结果如图3所示，固定化酶催化性能和重复使用性能良好。
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