[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 1982442A [43]公开日2007年6月20日
[21]申请号200610034384.4[22]申请日2006.03.17
[21]申请号200610034384.4
[71]申请人广东省微生物研究所
地址510070广东省广州市先烈中路100号
共同申请人广东环凯微生物科技有限公司
[72]发明人吴慧清 吴清平 张菊梅 李程思 [74]专利代理机构广州弘邦专利商标事务所有限公司代理人张钇斌 郭澄联
[51]Int.CI.C12N 9/02 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 8 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及一种规模化提取和纯化天然萤火虫
荧光素酶的方法，属生物技术领域。本发明在低温
条件下取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、
离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透
析、超滤、离心和阳离子交换法，可以去除99％的
本底，提高荧光素酶的发光比活力50倍以上；进一
步经一次分子排阻层析、亲和层析和二次分子排阻
层析，即可得到高纯度的荧光素酶，其活力和本底
之比可提高到5690倍。本发明解决了一般纯化方法
很难达到在去除本底的同时又保持萤光素酶活力的
缺陷，提供了一种从天然萤火虫中制备高活力低成
本的荧光素酶的方法，适用于规模化生产高活力荧
光素酶。
200610034384.4权 利 要 求 书第1/2页 1、一种规模化提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，包括：
(1)天然荧光素酶的提取：取天然萤火虫虫尾，在低温条件下添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；
(2)粗酶制剂的纯化：通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换柱层析等过程纯化；
(3)荧光素酶的精制：采用一次分子排阻层析、亲和层析和二次分子排阻层析进一步精制。
2、权利要求1所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中天然荧光素酶的提取过程为：
(1)天然荧光素酶的粗提纯
取天然萤火虫的虫尾，在4～10℃低温条件下按1∶2～5体积比加入酶提取A液研磨后，按1∶5～8体积比加入酶提取B液，在4℃下以5000～12000r/min离心10～20min，去除上层脂肪和下层沉淀，得到澄清的酶液；
(2)天然荧光素酶的硫酸铵分级沉淀
在低温条件下于上述澄清酶液中加硫酸铵至30～40％饱和度，放置2～12h，5000～12000r/min离心10～20min，去除沉淀得到上清酶液。继续加硫酸铵至70～90％饱和度，4℃下放置12～24h，以5000～12000r/m i n离心10～20m i n，得到荧光素酶的粗酶沉淀。
3、权利要求2所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中天然荧光素酶的提取过程所加的酶提取A液含25mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-Na2，2mmol/L PMSF，10％饱和硫酸铵，pH7.8；酶提取B液为：A液组份中不加PMSF。
4、权利要求1所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中粗酶制剂的纯化过程为： (1)复溶与透析
荧光素酶的粗酶沉淀加8～10倍酶复溶液，低温条件下在酶透析液中透析24～50h，加入3～5倍酶液体积的pH5.8～7.8的50mmol/L PBS，采用5000～12000r/min离心10～20min，去除沉淀得到澄清的酶液；
(2)超滤浓缩并更换缓冲液
在低温条件下通过超滤浓缩使酶液体积减少至超滤前的1/8～1/10体积，采用pH5.8～7.8的50mmol/L PBS洗滤；超滤条件依需要浓缩的体积和要求的时间决定，一般情况下，在低温下超滤时间不超过2h，超滤膜包选用10K，转速依仪器的性能选定。
200610034384.4权 利 要 求 书 第2/2页
(3)阳离子柱纯化
阳离子交换柱的交换介质为SP SEPHAROSE FF，采用线性梯度洗脱或步级梯度洗脱，根
据酶活力测试收集酶峰，合并酶液，超滤法去盐。
5、权利要求1所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中荧光素酶的精制过程为： (1)一次分子排阻层析
经阳离子交换纯化的荧光素酶液，缓慢加硫酸铵至70～90％饱和度，于4℃条件下保存3～10天，5000～12000r/min离心10～20min；酶泥用适量酶复溶液复溶，得到液体酶后上分子
排阻层析柱S-200，流速0.8～1.7mL/min，洗脱液为酶复溶液，经酶活检测后收集活力组份，
得一次分子排阻层析的纯化酶；
(2)亲和层析
将上述分子排阻层析纯化酶液导入经酶复溶液平衡好的亲和层析柱Hitrap TM 1mL Blue HP
或Hitrap T M 5mL Blue HP；洗脱液A液为酶复溶液，洗脱液B液为A液+2mol/L NaCl；上样
速度：1～4ml/min，洗脱速度：6～10ml/min，采用线性梯度洗脱或步级梯度洗脱，经酶活检
测后收集活力组份；
(3)二次分子排阻层析
经亲和层析柱的纯化酶液，用PEG浓缩后，再次上分子排阻层析G-75柱，流速0.8～1.7mL/min，洗脱液为酶复溶液，经酶活检测后收集活力组份得到二次分子排阻层析纯化酶，
合并酶液，按体积比1∶1加上酶保护剂，冷冻干燥，即得高纯度的荧光素酶。
6、权利要求4或5所述提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中所用的酶复溶液含50mmol/L NaHCO3、10mmol/L Tris、1.0mmol/L EDTA、pH7.8。
7、权利要求4所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中所用的酶透析液含0.1mol/L NaCl、10～100mmol/L PBS、10％乙二醇(V/V)、pH7.5。
8、权利要求4所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，其中阳离子柱层析选用直径和长度比为16mm/10cm或26mm/10cm或35mm/32cm；洗脱缓冲液A液为50mmol/L PBS，pH5.8～7.8；
洗脱缓冲液B液：洗脱缓冲液A液+2mol/L NaCl，pH5.8～7.8；上样量不超过柱的容量；上样
速度1～4mL/min，洗脱速度6～10ml/min。
9、权利要求4所述的提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，荧光素酶保护剂的配制方法：取100～1000mg海藻糖、50～1000mg PEG6000及10～200mg BSA，溶解于10mL无菌馏水中，进行
无菌过滤除菌即可。
200610034384.4说 明 书第1/8页
规模化提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法
[所属技术领域]
本发明涉及一种规模化提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，属生物技术领域。 [背景技术]
荧光素酶是ATP生物发光检测体系中一个关键成份，近年来主要有两种生产方式，一是通过萤火虫来提取纯化，其原材料要依靠人工捕捉或通过农场或实验室大量养殖；另一方法是通过基因工程的方法生产。早在1884年，Dubols就已开始收集萤火虫发光尾部，研究其发光的化学本质。1887年明确萤火虫发光涉及荧光素、虫光素酶和氧。1958年Green 和McElory首次得到结晶的荧光素酶。1974年McElory指出高能磷酸化合物ATP在生物发光中起重要作用。此后，欧、美、日等在研究生物发光同时，依据荧光素酶和ATP之间的关系开始在生物、医学、环卫等方面付诸实用。另一方面，1985年De WET，J.R.等首次克隆了萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶(简称FL)基因，1986年，De WET，J.R.测定了FL基因的cDNA序列，随后各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并在原核和真核基因中表达。迄今，该领域国际发展动向可归纳为以下几点：1)美、德等通过农场或实验室大量养殖萤火虫以
制备萤光素酶，从而使应用日益扩大，并取得可观的经济效益(2004年价格，美国Sigma公司为196.10美元/mg)。2)美、法、日等大力研究虫光素酶的固定化技术及光纤感应元件制作技术，从而使检测连续化、稳定化、精确化。3)批量生产高灵敏、便携式，适用于不同应用目的发光检测仪器。4)拓展荧光素酶应用范围，提高检测精度，降低使用成本。5)克隆萤光素酶基因及对萤光素酶基因进行定点突变以期消除萤光素酶的温度敏感性。
萤光素酶的两种生产方式各有优缺点，从自然界或养殖的萤火虫中提取荧光素的方法，可以用较少的成本获得产品，并且不用担心基因变异丢失等不稳定因素，但来源受季节性限制。而基因工程方法，虽可以不受季节和地域的限制，并可以对萤光素酶基因进行一些改造，使生产的萤光素酶降低对温度的敏感性，但工程菌的构建比较麻烦，花费大，且构建好的工程菌也存在不稳定的因素。
萤光素酶商业制剂主要有三种不同纯度的商品：1)粗的萤光素酶提取物，2)部分纯化的萤光素酶，3)纯度较高的结晶萤光素酶。不同的用途对萤光素酶制剂的要求不同，对灵敏度要求不高的可用部分纯化的产品，对灵敏度要求高的样品，必须使用高灵敏度的萤光
200610034384.4说 明 书 第2/8页素酶制剂。ATP生物发光检测法的检测灵敏度由试剂的质量、仪器的性能和样品处理方式等三个方面的因素决定，其中发光试剂的质量主要由荧光素酶的质量决定，在ATP生物发光法中提高生物发光试剂中荧光素酶的纯度和比活力对提高检测灵敏度极其重要。但由于
天然萤火虫中荧光素酶蛋白含量不高，对温度又很敏感，而且萤火虫中除含有大量的脂肪外，还含有大量的各种杂酶和荧光素，因此一般的纯化方法很难达到在去除本底的同时又保持萤光素酶的活力。
[发明内容]
本发明针对一般的纯化方法存在的问题，创建起一套从天然萤火虫中制备高活力低成本的荧光素酶的提取和纯化方法，以用于规模化生产荧光素酶。
本发明包括三部分内容，一是天然荧光素酶的提取，在低温条件下从天然萤火虫虫尾，通过添加提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到含荧光素的粗酶制剂；二是粗酶制剂的纯化，通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法去除99％的本底，提高荧光素酶的发光比活力50倍以上；进一步的荧光素酶的精制包括进行一次分子排阻、亲和层析和二次分子排阻层析，其活力和本底之比可提高到5690倍。
本发明的具体操作方法如下：
1.天然荧光素酶的提取
(1)天然荧光素酶的粗提纯
剪取天然萤火虫的虫尾，在4℃低温条件下按l∶2～5体积比加入酶提取B液研磨后，按l∶5～8体积比加入
酶提取A液，在4℃条件下以5000～12000r/min离心10～20min，去除上层脂肪和下层沉淀，得到澄清的酶液。
酶提取B液：含25mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-Na2，2mmol/L PMSF(苯磺酰氟)，10％饱和硫酸铵，pH7.8；酶提取A液：B液组份中不加PMSF。
(2)天然荧光素酶的硫酸铵分级沉淀
在低温条件下于上述澄清酶中加硫酸铵至30～40％饱和度，放置2～12h，5000～12000r/min离心10～20min去除沉淀，得到上清酶液，继续加硫酸铵至70～90％饱和度，4℃条件下放置12～24h，以5000～12000r/min离心10～20min，得到荧光素酶的粗酶沉淀，冷冻干燥后可得含荧光素的粗酶制品。
2.天然荧光素酶粗酶的纯化
(1)复溶与透析
荧光素酶的粗酶沉淀加8～10倍酶复溶液(50mmol/L NTE，pH7.8缓冲液)，低温条件下在酶透析液(含0.1mol/L NaCl，10～100mmol/L PBS，10％乙二醇(V/V)，pH7.5)中透
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