(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810893791.3
(22)申请日 2018.08.08
(71)申请人 福建医科大学
地址 350004 福建省福州市台江区交通路
88号
(72)发明人 陈伟 彭花萍 邓豪华 黄种南
陈睿婷
(74)专利代理机构 福州智理专利代理有限公司
35208
代理人 王义星
(51)Int.Cl.
G01N 21/76(2006.01)
G01N 27/327(2006.01)
(54)发明名称
酸酶测定方法
(57)摘要
本发明公开一种基于纳米金簇电致化学发
光探针的碱性磷酸酶测定方法。所述纳米金簇电
致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法是采用
还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光
探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝
灭剂，利用碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L -抗
坏血酸三钠盐产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧
化还原反应恢复电致化学发光信号，实现对碱性
磷酸酶含量的测定。在1.0×10-4~2.0×102 U/L
的浓度范围内碱性磷酸酶浓度的对数值与相对
电致化学发光强度变化值呈线性关系，检测限为
1.5×10-5 U/L。具有操作简单、成本低、灵敏度
高、重现性好等优点，可用于实际样品中碱性磷
酸酶的测定，
具有较好的临床应用前景。权利要求书2页 说明书7页 附图3页CN 108872209 A 2018.11.23
C N 108872209
A
1.一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是：首先在电极表面修饰纳米金簇，通过还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光猝灭剂；将碱性磷酸酶加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液中，碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸，进而将修饰电极浸入上述反应液中，产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现碱性磷酸酶的测定。 2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是所述还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以纳米金簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L 、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施
加-1.4 V
~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min
~
1 h，得到电化学发光纳米
金簇探针；
（2）化学还原法：将纳米金簇修饰玻碳电极浸泡在0.1
~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5
min
~30 min，得到化学还原法制备的纳米金簇探针修饰电极。
3.根据权利要求1、2所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是所述纳米金簇为功能化修饰纳米金簇，采用N-乙酰化-L-半胱氨酸-纳米金簇或牛血清白蛋白-纳米金簇。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理纳米金簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电
极，采用I-t法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电化学沉积二氧化锰，电位为-0.1 V
~-
0.5 V，沉积时间为100 s
~600 s，清洗，氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0 V，脉冲时间为
10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s，光电倍增管高压设置为600
~800 V，检测电致化学
发光辐射信号。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是所述产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应的pH 为8.0，反应时间为4 min。
7.根据权利要求5所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1 mol/L。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是电致化学发光强度变化值与抗坏血酸浓度的对数值在1.0×10-4
~
2.0×102 U/
L的范围内呈良好的线性关系，检测限为1.5×10-5 U/L。
基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
[0002]碱性磷酸酶（Alkaline phosphates）是一种质膜结合糖蛋白，它能够催化核酸、蛋白质、磷脂等分子水解脱去其中的磷酸基团，在基因转移、细胞代谢、神经系统等生物过程中起着关键的作用。碱性磷酸酶在自然界中广泛分布（除了部分高等植物外），并广泛存在于人体的多种器官中，尤其是肝脏和骨骼中，其含量较高，而在胎盘、肾脏中含量相对较少。研究发现，碱性磷酸酶的含量高低与多种疾病的发生发展具有密切的关系，如在骨软化、肝功能障碍、阻塞性黄疸等疾病患者的血清中，碱性磷酸酶呈高表达状态。因此，在临床检测中，碱性磷酸酶被作为很多疾病的生物标志物。作为诊断多种疾病的关键生物标志物，碱性磷酸酶是临床实践中最常用的测定酶之一。目前，用于检测碱性磷酸酶检测的方法如比法，荧光分析法，化学发光法，表面增强拉曼光谱法，电化学方法等存在如灵敏度和准确度低、操作过程繁琐、费用较高、检测时间长等不足，极大地限制其在临床诊断中的应用。因此，建立简单、快速、高灵敏的碱性磷酸酶含量检测新方法具有重要的实际意义。
[0003]电致化学发光（Electrochemiluminescence，简称ECL）生物分析是近年来发展起来的一种新型分析方法, 是化学发光、电化学、生物分析、微电子技术以及传感技术相结合的最新产物。该分析方法具有操作简单、快速、选择性好、线性范围宽，及易控制等诸多优良的性能特点，并且ECL技术无需激发光源、背景信号底，不但可以有效避免常规荧光分析中的光漂白和背景干扰问题，而且比常规荧光分析法更为灵敏，已被广泛应用于临床诊断、药物、免疫、食品质量及其它物质的测定。近年来，基于量子点或纳米团簇的电致化学发光分析法，因具有背景信号低、灵敏度高、可控性好、试剂可以循环使用和分析测试范围广等优点，已在生物、医药，和环境等领域得到了广泛的应用。纳米金簇作为新型纳米发光体，具有无毒、水溶性好、比表面积大、制备条件温和、表面易修饰，且具有特殊光电性质等特点，己在生物医药、临床分析、传感检测和催化等领域广泛应用。本课题组通过纳米尺度调控成功实现高量子产率纳米金簇电致化学发光探针的制备，并在此基础上建立了一系列新型高效电致化学发光生命分析平台。
[0004]本发明以纳米金簇为电致化学发光探针，以二氧化锰纳米片为猝灭剂，基于碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，建立一种高灵敏、高选择、快速的碱性磷酸酶测定新方法。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种以纳米金簇为电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于纳米金簇电致化学发光
探针的碱性磷酸酶测定方法，其特征是：首先在电极表面修饰纳米金簇，通过还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光猝灭剂；将碱性磷酸酶加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液中，碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸，进而将修饰电极浸入上述反应液中，产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现碱性磷酸酶的测定。
[0007]所述还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以纳米金簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L 、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施
加-1.4 V
~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min
~
1 h，得到电化学发光纳米
金簇探针；
（2）化学还原法：将纳米金簇修饰玻碳电极浸泡在0.1
~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5
min
~30 min，得到化学还原法制备的纳米金簇探针修饰电极。
[0008]所述纳米金簇为功能化修饰纳米金簇，采用N-乙酰化-L-半胱氨酸-纳米金簇或牛血清白蛋白-纳米金簇。
[0009]所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理纳米金簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，
采用I-t法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电化学沉积二氧化锰，电位为-0.1 V
~-0.5
V，沉积时间为100 s
~600 s，清洗，氮气吹干。
[0010]所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0 V，脉冲时间为10
s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s，光电倍增管高压设置为600
~800 V，检测电致化学发光
辐射信号。
[0011]所述产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应的pH 为8.0，反应时间为4 min。
[0012]采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的pH 值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1 mol/L。
[0013]电致化学发光强度变化值与抗坏血酸浓度的对数值在1.0×10-4
~2.0×102 U/L的
范围内呈良好的线性关系，检测限为1.5×10-5 U/L。
[0014]具体地说，为了实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：将纳米金簇修饰在玻碳电极上，通过还原法制备高量子产率纳米金簇电致化学发光探针，进而在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料；将碱性磷酸酶加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液中，碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸，进一步将二氧化锰/纳米金簇修饰电极浸入上述反应液中；采集修饰电极的电致化学发光信号，利用反应液中产生的抗坏血酸与电极表面的二氧化锰发生氧化还原反应恢复电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的变化实现碱性磷酸酶的测定。
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