(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710574017.1
(22)申请日 2017.07.14
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2017319 2017.06.09
CCTCC NO:M2017298 2017.06.02
(71)申请人 安徽农业大学
地址 230036 安徽省合肥市长江西路130号
(72)发明人 曹媛媛 赵为容 唐欣昀 陈晓琳
孙乐妮 邓瑞宁 郭婷婷
(74)专利代理机构 合肥和瑞知识产权代理事务
所(普通合伙) 34118
代理人 王挺
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C09K 17/14(2006.01)
C12R 1/38(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C09K 101/00(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种
复合溶磷菌剂，由溶磷菌WS32与溶磷菌P1616混
合发酵制成，所述溶磷菌WS32的分类命名为假单
胞菌(Pseudomonas sp.)，2017年6月9日保藏在
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC
NO:M 2017319，所述溶磷菌P1616的分类命名为
芽孢杆菌(Bacillus sp.)，2017年6月2日保藏在
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC
NO:M 2017298。本发明的有益效果是：1、本发明
的WS32和P1616与小麦具有亲和性，可与小麦凝
集素发生凝集反应，可在小麦根部长期定居存
活，发挥促进小麦生长的作用。2、本发明的复合
菌剂具有强的产有机酸和磷酸酶能力，保证高效
溶磷、
解磷效果。权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图3页CN 107164288 A 2017.09.15
C N 107164288
A
1.一种复合溶磷菌剂，其特征在于，由溶磷菌WS32与溶磷菌P1616混合发酵制成，所述溶磷菌WS32的分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，2017年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017319，所述溶磷菌P1616的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，2017年6月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017298。
2.根据权利要求1所述的一种复合溶磷菌剂，其特征在于，所述复合溶磷菌剂为液态复合溶磷菌剂或者固态复合溶磷菌剂。
3.一种如权利要求2所述的复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态复合溶磷菌剂的制备方法如下，
将溶磷菌WS32和溶磷菌P1616的菌液按1：0.5～2的体积比混合，其中两种菌液中的菌数均在1×108～9×108CFU/mL范围内，然后将混合的菌液以2～5％的接种量接入80～120mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在25～30℃、120～180r/min的条件下，震荡培养18～48h，即制得所述液态复合溶磷菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态复合溶磷菌剂的制备方法如下，
在所述液态复合溶磷菌剂中加入干燥的泥炭60～180g混匀，即制得所述固态复合溶磷菌剂。
5.根据权利要求3所述的一种复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述得到的液态复合溶磷菌剂中溶磷菌WS32和溶磷菌P1616的总菌数为1×108～9×108CFU/mL。
6.权利要求1所述的一种复合溶磷菌剂，其特征在于，所述复合溶磷菌剂在促进小麦的生长、促进小麦对磷素吸收以及降低化肥使用量的应用。
7.权利要求1所述的一种复合溶磷菌剂，其特征在于，所述复合溶磷菌剂用于小麦的拌种或包衣或浇根或蘸根。
8.根据权利要求3所述的一种复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量为1～4L。
9.根据权利要求4所述的一种复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量为1～4kg。
权 利 要 求 书1/1页CN 107164288 A
一种复合溶磷菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合溶磷菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]磷是植物生长必需的营养物质之一，对于植物生长至关重要，但是土壤中的大部分有机磷和无机磷却不能直接被植物吸收利用。我国74％的耕地土壤缺磷，且土壤中95％以上的磷为无效磷，造成有效磷资源的极度匮乏。施用磷肥可给植物提供磷素养分，但植物对磷肥的当季利用率一般只有5％～ 25％，由于耕地长期施用磷肥，大部分磷肥作为无效态在耕地土壤中积累，对生态环境造成影响。
[0003]土壤溶磷微生物不但能够促进植物对各种营养元素的吸收，促进植株根系的生长，提高植物对磷的利用率，改善植物营养条件，提高作物产量，增加植株抗病能力，还可改善土壤结构，提高有机
质含量，改良盐碱地，对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境具有重要作用。因此，土壤溶磷微生物的研究具有良好的发展前景和应用意义。
发明内容
[0004]为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种复合溶磷菌剂，可以高效的将土壤中的无效磷转换为可供小麦直接吸收的优质磷。
[0005]本发明提供了如下的技术方案：
[0006]本发明的复合溶磷菌剂，由溶磷菌WS32与溶磷菌P1616混合发酵制成，所述溶磷菌WS32的分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，2017年6 月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017319，保藏单位地址为武汉大学，所述溶磷菌P1616的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，2017 年6月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017298，保藏单位地址为武汉大学。
[0007]本发明菌株形态特征：溶磷菌WS32菌株为革兰氏阴性菌，菌落整齐，呈淡黄，接触酶试验显示阴性，淀粉酶试验显示阳性；溶磷菌P1616为革兰氏阳性菌，菌落不整齐，呈白，有芽孢，接触酶试验显示阳性，淀粉酶试验显示阳性。
[0008]本发明复合溶磷菌剂为液态复合溶磷菌剂或者固态复合溶磷菌剂。
[0009]本发明液态复合溶磷菌剂的制备方法如下，
[0010]将溶磷菌WS32和溶磷菌P1616的菌液按1：0.5～2的体积比混合，其中两种菌液中的菌数均在1×108～9×108CFU/mL范围内，然后将混合的菌液以2～5％的接种量接入80～120mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在25～30℃、 120～180r/min的条件下，震荡培养18～48h，即制得液态复合溶磷菌剂。
[0011]本发明固态复合溶磷菌剂的制备方法如下，
[0012]在上述液态复合溶磷菌剂中加入干燥的泥炭60～180g混匀，即制得固态复合溶磷菌剂。
[0013]本发明的液态复合溶磷菌剂中溶磷菌WS32和溶磷菌P1616的总菌数为 1×108～9
×108CFU/mL。
[0014]本发明复合溶磷菌剂在促进小麦的生长、促进小麦对磷素吸收以及降低化肥使用量的应用。
[0015]本发明复合溶磷菌剂用于小麦的拌种或包衣或浇根或蘸根。
[0016]本发明液态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量为1～4L，固态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量为1～4kg。
[0017]WS32的16SrRNA如SEQ ID NO.1所示，P1616的16SrRNA如SEQ ID NO.2所示。[0018]本发明的有益效果是：
[0019]1、本发明的WS32和P1616与小麦具有亲和性，可与小麦凝集素发生凝集反应，可在小麦根部长期定居存活，发挥促进小麦生长的作用。
[0020]2、本发明的复合菌剂具有强的产有机酸和磷酸酶能力，保证高效溶磷、解磷效果。[0021]3、采用本发明的WS32和P1616制备的液态复合溶磷菌剂或固态复合溶磷菌剂具有显著的溶磷效果，既能溶解难溶态无机磷，又能降解难溶态有机磷，利用WS32和P1616自身的代谢能力将不溶态的无机磷素和有机磷素释放出来，大幅度提高菌液中或土壤中速效性磷的含量。
[0022]4、本发明的复合溶磷菌剂使用方法简单，可采用拌种、包衣、浇根、蘸根等方法进行接种。
[0023]5、本发明的液态复合溶磷菌剂或固态复合溶磷菌剂的施用剂量低，液态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量仅为1～4L，固态复合溶磷菌剂每亩小麦田施用量仅为1～4kg，与其它每亩小麦田施用量为30～50kg的大剂量的生物肥料产品相比较，本发明可大幅度降低生产成本，节能环保。
附图说明
[0024]图1是难溶性无机磷磷酸三钙培养基发酵液中可溶性磷浓度；
[0025]图2是难溶性有机磷植酸钙培养基发酵液中溶磷菌产酸性磷酸酶活性
[0026]图3是WS32的菌落图；
[0027]图4是P1616的菌落图；
[0028]图5是WS32与P1616菌液体积比为1:1的菌落图；
[0029]图6是WS32与P1616菌液体积比为1:2的菌落图；
[0030]图7是WS32与P1616菌液体积比为2:1的菌落图。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
[0032]实施例1WS32菌株与P1616菌株的筛选
[0033]采用选择培养基结合凝集素筛选法从小麦根际筛选出与小麦具有特异亲和作用的小麦根际溶磷菌29株；选用不同的溶磷培养基，分别添加 Ca3(PO4)2、FePO4、AlPO4、CaHPO4·2H2O等难溶性无机磷，以及卵磷脂、植酸钙等难溶性有机磷；采用钼锑抗比法测定各菌株发酵液中可溶性磷的浓度，测定29株菌株对不同形态难溶磷的溶解能力，确定其中5株菌溶磷效果较好。将这5株小麦高效溶磷菌分别以不同比例两两混合培养，测定其溶
磷能力，发现其中WS32菌株与P1616菌株溶磷效果最佳，将两株菌经 16SrRNA分子测序确定WS32为假单胞菌属，P1616为芽孢杆菌属。
[0034]实施例2复合溶磷菌剂的溶磷能力
[0035]将WS32和P1616菌液分别按体积比1：0、0：1、2：1、1：1、1：2 混合，其中两种菌液中的菌数均在1×108～9×108CFU/mL范围内，以3％的接种量接入磷酸三钙培养基，三角瓶培养，培养条件为160r/min、28℃、培养 9天；采用钼锑抗比法每天定时测定发酵液中可溶性磷的浓度，结果如图1所示，图1中，W:P表示WS32：P1616，复合溶磷菌较单菌株的溶磷效果大大提高。
[0036]实施例3复合溶磷菌剂分泌有机酸和磷酸酶能力
[0037](1)溶磷菌解无机磷原理为分泌有机酸，溶解土壤中难溶态无机磷为可溶态磷，供植物吸收利用。
[0038]采用磷酸三钙培养基，高效液相谱法测有机酸种类和浓度。液体摇瓶培养7d，取菌液1mL，离心，再经0.22μm滤膜真空抽滤后上液相谱。分离条件：谱柱为Hypersil C18 (250nm×4.6mm i d，5μm)，流动相为0.02 mol/L的KH2PO4缓冲溶液-甲醇溶液(99％:1％)，用1mol/L磷酸调节pH至 2.60，紫外检测波长210nm，进样量10μL，流速0.5mL/min，柱温30℃，得到表1。
[0039]由表1可见，复合溶磷菌在磷酸三钙培养基中产生的有机酸种类更多，浓度更大，有利于对难溶态无机磷的溶解。
[0040]表1高效液相谱法对菌株分泌有机酸种类和浓度的测定
[0041]
[0042](2)溶磷菌解有机磷原理为产生磷酸酶，通过磷酸酶的酶降解作用，将土壤中的难溶性有机磷降
解为有效磷。
[0043]对菌液中磷酸酶活性的测定采用植酸钙培养基，磷酸苯二钠法测定。结果如图2所示。图2中，W:P表示WS32：P1616，复合溶磷菌酸性磷酸酶活性最高，这加速了植酸钙的分解，促进磷素释放，从而提高小麦磷素营养。
[0044]实施例4液态溶磷菌剂的制备以及用于小麦的盆栽实验
[0045]液态溶磷菌剂包括液态复合溶磷菌剂、液态WS32溶磷菌剂和液态 P1616溶磷菌剂。
[0046]液态复合溶磷菌剂的制备
[0047]将WS32和P1616菌液分别按体积比2：1、1：1、1：2混合，其中两种菌液中的菌数均在1×108～9×108CFU/mL范围内，并以3％的接种量接入 100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28℃、160r/min条件下，震荡培养 30h，即制得液态复合溶磷菌剂。
[0048]液态WS32溶磷菌剂的制备
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