(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010942944.6
(22)申请日 2020.09.09
(71)申请人 天津理工大学
地址 300384 天津市西青区宾水西道391号
(72)发明人 曾林涛 朱北童 陈天宏
(74)专利代理机构 天津耀达律师事务所 12223
代理人 张耀
(51)Int.Cl.
C07D 311/16(2006.01)
C09K 11/06(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
G01N 21/78(2006.01)
(54)发明名称
法和用途
(57)摘要
一种用于检测尸胺的荧光探针及其制备方
法和用途，该探针是具有以下结构的香豆素衍生物：其中：R 1、R 2分别为
氢质子、1～18个碳的烷基、芳基中的一种。该探
成具有不同结构的香豆素衍生物，可实现对尸胺
的增强型荧光检测，且本发明提供了一种新的具
有复合信号响应的检测手段，即颜和荧光双重
响应。本发明所述的荧光探针，成本低，选择性
好，可实现对鱼和肉的无创检测，在食品中尸胺
的检测中具有很大的应用前景，
极具推广意义。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 111995604 A 2020.11.27
C N 111995604
A
1.一种用于检测尸胺的荧光探针，其特征是，所述的荧光探针是具有以下结构的香豆
素：
其中：R 1、R 2分别为氢质子、1～18个碳的烷基、芳基中的一种。
2.一种如权利要求1所述的用于检测尸胺的荧光探针的制备方法，具体的合成路线和
合成步骤为：
步骤(1)，化合物Ⅰ的制备：将2,4,6-三氯苯基马来酸二酯和带有取代基R 1、R 2的苯酚以及有机溶剂依次加入三口圆底烧瓶中，然后将反应混合物通入氮气加热至回流反应，1-12h 后反应停止，待反应混合物恢复至室温，真空抽滤除去多余的溶剂，然后将过滤残余物用有机溶剂甲苯洗涤三次，真空干燥后得到化合物Ⅰ；
步骤(2)，荧光探针的制备：将化合物Ⅰ、三氯氧磷和无水N ,N -二甲基甲酰胺依次加入圆底烧瓶中，在氮气氛围下，加热至50-100℃反应，3-18h后停止加热，待反应混合物冷却至室温，将反应混合物倒入冰水中，然后用饱和碳酸氢钠溶液调节pH直至中性析出固体，最后所得到固体粗产物经真空抽滤并重结晶，得到的橙固体为目标荧光探针。
3.根据权利要求2所述一种用于检测尸胺的荧光探针的制备方法，其特征在于带有取代基R 1、R 2的苯酚，其中：R 1、R 2分别为氢质子、1～18个碳的烷基、芳基中的一种。
4.一种根据权利要求1所述的用于检测尸胺的荧光探针的用途，其特征是：该探针用于检测鱼和肉中尸胺的浓度。
5.根据权利要求4所述的用于检测尸胺的荧光探针的用途，其特征是：根据溶液体系的颜和荧光两个特征判断尸胺含量。
6.根据权利要求4或5所述的用于检测尸胺的荧光探针的用途，其特征是：检测方法是，将探针分子溶解在生理盐酸或磷酸缓冲液中，或者将探针分子溶解在甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜或二甲酰胺有机溶剂中，或者将探针分子溶解在水和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂中，最终配制成浓度为1～2×10-5摩尔/升的探针溶液；然后在溶解有探针分子的上述探针溶液中加入不同浓度的含有尸胺的样品溶液。
7.根据权利要求6所述的用于检测尸胺的荧光探针的用途，其特征是：样品溶液与探针溶液的用量比为10微升：1毫升。
权 利 要 求 书1/1页CN 111995604 A
一种用于检测尸胺的荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种检测鱼和肉中尸胺的浓度的荧光探针及其制备方法和用途。通过颜和荧光双重可视化信号变化来检测尸胺的浓度。
背景技术
[0002]尸胺是一种在动物身体组织腐烂时由蛋白质水解产生的具有腐臭气味的化合物，常温下为浆状液体，深度冷冻可凝固结晶。尸胺是尸臭的主要味道之一。尸胺具有腐蚀性，可被人体吸入，食入或经皮吸收，对眼睛，粘膜，皮肤及呼吸道有强烈的刺激作用，可以引起烧灼伤。尸胺吸入后可能引起咽喉，支气管炎症，痉挛，水肿，肺水肿或化学性肺炎甚至导致死亡。中毒后有咳嗽，喘息，气短，咽炎，头痛，恶心或呕吐等症状。小鼠急性经口毒性最低致死量为270mg/kg。此外，尸体中的尸胺含量是最显著的腐败指标。因此，对鱼和肉的食品安全保护是必不可少的，开放发有效检测尸胺的方法已经成为了当务之急。
[0003]到目前为止，检测尸胺的方法包括气-质联用，电化学法，分光光度法和液相谱法。然而，这些方法仍然存在着一些不足。样品制备过程费时费力，需要昂贵且复杂的仪器，灵敏度低一级选择性不好的等。近年来，荧光探针技术由于其高灵敏度、高选择性、实时检测和操作简易已被评估为强大的检测工具。荧光探针具有操作简便，可视化，灵敏度高，选择性好和无创性的优点，已经成为了检测生物胺的有力工具。由于尸胺本身不能发射荧光，所以使用荧光光度法测定尸胺主要是基于荧光探针与尸胺在一定条件下发生反应，生成与荧光探针自身荧光性质不同的产物，根据荧光强度的变化可测得尸胺的含量。考虑到鱼和肉中食品安全的重要性，开发用于快速、选择性好和高灵敏度测定食品中尸胺含量的新型荧光探针是非常重要且具有巨大挑战性的。
[0004]当前，食品安全问题越来越受到社会各界的重视。食品安全的保障依赖于可靠的技术检测手段，
因此，开发一种操作简便，成本低廉的技术检测手段来检测鱼和肉中尸胺的需求是迫切的。所以制备性能优良的荧光探针应成为食品中尸胺现场快速检测的主流技术，是当前和今后一段时期内食品中尸胺含量快速检测的首选方法，更为食品生产厂家的自我监控和市场监督提供有力的技术保障。
发明内容
[0005]本发明的目的之一是克服现有技术中用于检测食品中尸胺的工具的性能和结构上的不足，提供一种新型的性能优良的荧光探针。
[0006]本发明的目的之二是针对尸胺提供一种新的具有复合信号响应的检测手段，即颜和荧光双重响应，两种信号相互佐证，增加可信度。
[0007]本发明的目的之三是提供能用于检测尸胺的荧光探针的制备方法及用途。[0008]本发明的用于同时检测尸胺的荧光探针是具有以下结构的香豆素衍生物：
[0009]
[0010]其中：R1、R2分别为氢质子、1～18个碳的烷基、芳基中的一种。
[0011]本发明的用于同时检测尸胺的荧光探针的制备方法，具体的合成路线和合成步骤为：
[0012]
[0013](1)将2,4,6-三氯苯基马来酸二酯和带有取代基R1、R2的苯酚以及有机溶剂依次加入三口圆底烧
瓶中，然后将反应混合物通入氮气加热至回流反应，1-12h后反应停止，待反应混合物恢复至室温，真空抽滤除去多余的溶剂，然后将过滤残余物用有机溶剂甲苯洗涤三次，真空干燥后得到化合物Ⅰ；
[0014](2)将化合物Ⅰ、三氯氧磷和无水N,N-二甲基甲酰胺依次加入圆底烧瓶中，在氮气氛围下，加热至50-100℃反应，3-18h后停止加热，待反应混合物冷却至室温，将反应混合物倒入冰水中，然后用饱和碳酸氢钠溶液调节pH直至中性析出固体，最后所得到固体粗产物经真空抽滤并重结晶，得到的橙固体为目标荧光探针。
[0015]所述的带有取代基R1、R2的苯酚，其中：R1、R2分别为氢质子、1～18个碳的烷基、芳基中的一种。
[0016]本发明的检测尸胺含量的荧光探针能够用于检测鱼和肉中尸胺的浓度；根据溶液体系的颜和荧光两个特征判断尸胺含量；具体做法是：将探针分子溶解在生理盐酸或磷酸缓冲液(PBS)中，或者将探针分子溶解在甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜或二甲酰胺有机溶剂中，或者将探针分子溶解在水和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂中，最终配制成浓度为1～2×10-5摩尔/升的探针溶液；然后在溶解有探针分子的上述探针溶液中加入不同浓度的含有尸胺的样品溶液，样品溶液与探针溶液的用量比为10微升：1毫升。
[0017]相对于现有的技术，本发明具有如下优点与技术效果：
[0018]本发明合成的探针化合物的结构是氯取代的醛基香豆素衍生物，其中醛基和卤素作为双识别基团能够同时与尸胺发生反应，通过成环结构的变化将信号传导至香豆素荧光基团，促使其荧光强度发生改变，从而可用于增强型荧光检测。该探针分子结构简单，易于合成，且对尸胺有很好的选择性，因此在检测食品中尸胺时，不受其他分子的干扰。该探针溶液的吸光度和荧光强度与亚硝酸盐的浓度在一定的浓度范围内(亚硝酸盐浓度范围：0～5×10-4摩尔/升)均有良好线性关系，表现出良好的实际应用性。同时，本发明的检测尸胺含
量的荧光探针在使用时没有特殊的限制，在普通室温及其他温和条件下即可完成检测，经济实用。且本发明的荧光探针辨识度高，测定灵敏度高，制作过程简单，成本低廉，使得其极易实际推广应用。
附图说明
[0019]图1.本发明实施例1中的荧光探针的一维氢核磁谱图，横坐标为化学位移，纵坐标为信号强度。
[0020]图2.本发明实施例1中的探针对尸胺的选择性，横坐标为不同离子活性分子，纵坐标为荧光强度。
[0021]图3.本发明实施例1中的荧光探针的吸光度和尸胺浓度的线形关系，横坐标为尸胺的浓度，纵坐标为吸光度。
[0022]图4.本发明实施例1中的荧光探针的荧光强度和尸胺浓度的线形关系，横坐标为尸胺的浓度，纵坐标为荧光强度。
[0023]图5.本发明实施例1中的荧光探针对食品(鱼肉)中不同浓度尸胺的检测效果图片。
具体实施方式
[0024]实施例1
[0025]一种用于检测尸胺的荧光探针结构如下：
[0026]
[0027]具体的制备方法步骤如下：
[0028](1)将2,4,6-三氯苯基马来酸二酯1mmol和3-(二乙氨基)苯酚1mmol溶解在16mL无水甲苯中，在氮气气氛下回流2小时。反应完成后，将反应液冷却至室温并进行真空过滤，所得的过滤残余物用蒸馏洗涤3次。得到灰固体产物4-羟基-7-N，N-二乙胺基香豆素。[0029](2)将2mL无水N，N-二甲基甲酰胺加入三颈烧瓶中，在冰浴下缓慢滴加0.80mL三氯氧化磷，并在氮气气氛下搅拌30分钟。将化合物4-羟基-7-N，N-二乙胺基香豆素替代4mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，并添加至上述混合液中。将混合液在室温搅拌30分钟。在氮气氛下于60℃回流。反应完成后，将反应溶液倒入50mL冰水中，并用NaOH溶液将pH调节至中性并沉淀出固体。真空抽滤，所得的滤渣在氯仿和甲苯中重结晶。目标荧光探针。所得荧光探针的一维氢核磁谱图见附图1。
[0030]1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ/ppm 10.32(s,1H),7.87(d,J＝9.3Hz,1H),6.71 (dd,J＝9.3,2.5Hz,1H),6.46(d,J＝4.8Hz,1H),3.51(q,J＝7.2Hz,4H),1.28(t,J＝7.1Hz, 6H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ/ppm 186.99,159.93,156.43,154.05,153.67, 129.27,110.95,110.57,107.66,96.59,45.35.
[0031]检测试剂的配制：
[0032](1)探针溶液的配制：称取固体探针，用乙醇溶解，配制成探针浓度为1mM的探针-
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