(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710280998.9
(22)申请日 2017.04.26
(71)申请人 北京盛美诺生物技术有限公司
地址 100062 北京市东城区崇文门外大街3
号新世界写字楼B座1306室
申请人 海南盛美诺生物技术有限公司
(72)发明人 刘爱青 王海燕 张贵锋 刘爽
(74)专利代理机构 中国商标专利事务所有限公
司 11234
代理人 曾海艳
(51)Int.Cl.
C12P 21/06(2006.01)
C08B 37/08(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种含非变性II型胶原蛋白
的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法
依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过
滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步
骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软
骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/
20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获
得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃；所
述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋
白酶、金属蛋白酶中的一种或几种。本发明提供
的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率
高、易规模化生产、且富含非变性Ⅱ型胶原蛋白
和硫酸软骨素。权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 106916870 A 2017.07.04
C N 106916870
A
1.一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为
2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃；所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，所述酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。
3.根据权利要求1所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：
1。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，在干燥步骤后进行粉碎，其中，
脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的pH到5.5～8.5；
消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；
匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为50～300目；
过滤：利用5～100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液；
干燥：将过滤收集的过滤液进行低温干燥，干燥温度不高于30℃，干燥后获得软骨提取物；
粉碎：干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在100-500目。
5.根据权利要求4所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，所述脱脂剂是一定浓度的NaOH溶液、KOH溶液、Na 2CO 3溶液、NaCl溶液、KCl溶液中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，所述脱脂
剂的浓度为0.01～3重量％，所述脱脂剂与软骨的重量比为1～10:1。
7.根据权利要求4所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，消毒步骤中所使用的消毒液是次氯酸钠和/或双氧水，消毒过程中消毒液的浓度控制在100ppm～2000ppm，消毒时间控制在0.2h～12h。
8.根据权利要求4所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，匀浆步骤在37℃以下进行。
9.根据权利要求4所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，低温干燥方法是滚筒烘干法、低温长网烘干法、冷冻干燥法。
10.根据权利要求9所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，在有预冷的步骤时，预冷温度不高于-10℃，干燥后软骨提取物的含水量控制在6％以下。
权 利 要 求 书1/1页CN 106916870 A
一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及到一种软骨提取物的制备方法，特别涉及一种含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。
背景技术
[0002]胶原蛋白是皮肤、骨骼和关节等组织的重要的组成部分，是多细胞动物的细胞外基质的主要成分。目前从哺乳动物中已经发行27种不同类型的胶原蛋白，其中由三条相同的α链组成的Ⅱ型胶原蛋白主要存在于软骨组织中和眼玻璃体中，因此Ⅱ型胶原蛋白被视为软骨的一种结构功能性元素。
[0003]目前市面在销售胶原蛋白多为经过水解后的胶原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200-20000Da的范围内。虽然这些多肽也具有一定的保持皮肤水分、增强骨密度和增强免疫力等作用，但并无预防和因自身免疫机能变化引起的风湿性关节炎的功效，也不具有预防和退行性关节炎的作用。
[0004]非变性Ⅱ型胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的蛋白，当人体摄入非变性Ⅱ型胶原蛋白后，体内免疫细胞尤其是淋巴细胞的免疫耐受会发生改善，免疫耐受的原因是由于摄入的Ⅱ型胶原蛋白中含有抗原决定簇。抗原决定簇是抗原的一个特殊结构单元，能够被抗体识别和绑定，当抗体绑定到生物大分子时，抗体不能识别整个有机体或物质，但是能识别标位并进行绑定。活性抗原决定基被绑定在淋巴集结上作为一个组织存于小肠，去刺激免疫细胞、信息传递分子如细胞因子和参与增殖分化趋化因子并
抑制细胞分泌去抑制炎症。[0005]目前国内外也有一些非变性Ⅱ型胶原蛋白的提取工艺，但或是未对其原料进行除杂等预处理、或未对杂蛋白进行处理、或是提取率低、或是保存条件受限制。
发明内容
[0006]本发明目的之一是至少克服上述缺陷中的一种，提供一种新的含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。
[0007]因此，本发明提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。
[0008]本发明提供的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率高、易保存、易规模化生产，且富含非变性Ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。
[0009]附图说明书
[0010]图1为实施例1获得的非变性II型胶原蛋白的透射电镜图片。
[0011]图2表示实施例1和2获得的II型胶原蛋白的western印迹的结果，其中左侧泳道是实施例2获得的II型胶原蛋白，右侧泳道是实施例1获得的II型胶原蛋白。
具体实施方式
[0012]本发明提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。
[0013]本申请的发明人意外发现，在上述酶解条件下进行酶解，能够获得较高浓度的非变性Ⅱ型胶原蛋白。
[0014]在酶解步骤，所述酶可以采用本领域所用的任何酶，但是在一种优选的实施方式中，所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种；最优选为胃蛋白酶。
[0015]在一种优选的实施方式中，所酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。
[0016]在另一种优选的实施方式中，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，
木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：1。在该优选条件下，获得的软骨提取物中非变性Ⅱ型胶原蛋白浓度更高。
[0017]在一种优选的实施方式中，在干燥步骤后进行粉碎，其中，
[0018]脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的pH到5.5～8.5；
[0019]消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；
[0020]匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为50～300目；[0021]过滤：利用5～100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液；[0022]干燥：将过滤收集的过滤液进行低温干燥，干燥温度不高于30℃，干燥后获得软骨提取物；
[0023]粉碎：干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在100目-500目。
[0024]在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂是NaOH溶液、KOH溶液、Na2CO3溶液、NaCl 溶液、KCl溶液中的一种或几种。
[0025]在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂的浓度为0.01～3重量％，所述脱脂剂与软骨的重量比为1～10:1
[0026]在另一种优选的实施方式中，消毒步骤中所使用的消毒液是次氯酸钠和/或双氧水，消毒过程中消毒液的浓度控制在100ppm～2000ppm，消毒时间控制在0.2h～12h。[0027]在另一种优选的实施方式中，匀浆步骤在37℃以下进行。
[0028]在另一种优选的实施方式中，低温干燥方法是滚筒烘干法、低温长网烘干法、冷冻干燥法。
[0029]在另一种优选的实施方式中，在有预冷的步骤时，预冷温度不高于-10℃，干燥后
软骨提取物的含水量控制在6％以下。
[0030]在另一种优选的实施方式中，所述制备方法在脱脂前进行预处理，以获得更加纯净的胶原蛋白。该预处理可以按照现有技术进行，优选地该预处理包括：去除软骨原料上存在的脂肪、筋膜、残留的肉或红骨等非软骨物质，然后将其切成2mm～20mm的丁状物。[0031]在另一种优选的实施方式中，使用的原料软骨可以是鸡软骨、鸭软骨、牛软骨或其混合物。
[0032]实施例1
[0033](1)预处理：选取鸡胸软骨3.5kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成3*3mm的丁状。
[0034](2)脱脂：用终0.01％浓度的Na2CO3和2％NaCl的混合脱脂剂溶液7kg，常温脱脂4h，脱脂排水后用纯化水清洗至pH6.5。
[0035](3)消毒：加浓度400ppm次氯酸钠溶液开始消毒，消毒2次，每次12h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，pH控制在6.5-7.0。
[0036](4)匀浆：将步骤(3)处理的软骨丁状物加入6kg纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。
[0037](5)酶解：将步骤(4)获得的浆液pH调节至2.5，加入70克胃蛋白酶，加入60低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和10g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度25℃进行酶解20h。
[0038](6)过滤：利用5目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。
[0039](7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-40℃，干燥过程终温度控制在30℃，冻干后获得软骨提取物。
[0040](8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。
[0041]采用GB5009.5的方法检测胶原蛋白含量为55.2％，采用GB/T20365检测硫酸软骨素含量为7.9
％，采用ELISA方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性Ⅱ型胶原蛋白含量为11.3％。采用透射电镜检测非变性Ⅱ型胶原蛋白的形态，结果如图1所示。采用western印迹检测II型胶原蛋白，结果如图2右侧泳道所示。
[0042]实施例2
[0043](1)预处理：选取新鲜鸭胸软骨20kg，解冻后除去软骨上的鸭肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成约2mm*2mm的丁状.
[0044](2)脱脂：用终浓度为0.01％的NaOH和0.9％的KCl溶液200kg，常温脱脂6h，然后用纯化水清洗pH6.0。
[0045](3)消毒：加浓度500ppm次氯酸钠溶液(含100ppm的双氧水)开始消毒，消毒3次，每次6h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，pH控制在6.5-7.0。
[0046](4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入40kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成约100-200目。
[0047](5)酶解：将步骤(4)获得的浆液pH调节至8.5，加碱性蛋白酶0.2克，加入1kg低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度50℃，进行酶解12h。
[0048](6)过滤：利用100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。
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