(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010643149.7
(22)申请日 2020.07.07
(71)申请人 福建省农业科学院作物研究所
地址 350001 福建省福州市鼓楼区五四路
247号
(72)发明人 陈敏氡 王彬 朱海生 李永平
温庆放 刘建汀 叶新如 曾美娟
裘波音
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人 饶文君 蔡学俊
(51)Int.Cl.
C12N 15/29(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12Q 1/6895(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种
丝瓜内参基因EF ‑1α及其引物和应用。丝瓜内参
基因EF ‑1α核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。利
如SEQ ID No.2‑3所示。本发明利用BestKeeper，
GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和
Delta Ct法对EF ‑1α基因的稳定性进行评价，内
参基因EF ‑1α在高温、低温和ABA胁迫条件下最
稳定。本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特
异性强，具有很高的稳定性、可靠性和重复性，为
丝瓜温度胁迫和ABA胁迫等逆境胁迫下相关功能
基因的精确定量提供有力支持，提高了研究的稳
定性、
重复性和可靠性。权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 111676230 A 2020.09.18
C N 111676230
A
1.一种丝瓜内参基因EF -1α，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；且该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得；其中引物序列为：
正向引物5'- ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC -3'，
反向引物5'- TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT -3'。
2.一种丝瓜内参基因EF -1α的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：以权利要求1中所述内参基因的核苷酸序列为基础，设计获得一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为实时荧光定量PCR引物；其序列为：
正向引物5'-TCAAGAAGGTCGGATACA -3'，
反向引物5'-ACAGGGACAGTTCCAATAC -3'。
3.一种如权利要求1所述的丝瓜内参基因EF -1α在丝瓜高温、低温和ABA胁迫条件下基因表达分析中的应用。
4.如权利要求2所述的实时荧光定量PCR引物在丝瓜高温、低温和ABA胁迫条件下基因表达分析中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 111676230 A
一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用。
背景技术
[0002]丝瓜(Luffa cylindrica.L)是中国重要的夏季蔬菜之一，具有营养价值高、适应性广、耐热、耐湿、抗逆性强等优点，同时兼具药用功能，因此，种植丝瓜具有很大的商业价值和巨大的市场潜力。然而，在栽培过程中丝瓜植株时常会受到多种逆境胁迫的影响。因此，提高植株自身对逆境胁迫的抗逆性是丝瓜育种工作的重要目标之一。
[0003]随着分子生物学研究的不断发展，功能基因研究已成为植物抗逆育种的重要手段，基因表达分析则是植物功能基因研究的基础。为了避免不同样本初始模板量、RNA提取、酶促反应等背景误差，通常在基因表达分析中需要利用内参基因进行数据校正和标准化。理想的内参基因应该在不同组织类型、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。然而，近来的研究表明，适用于所有不同试验条件的内参基因并不存在。若只选取一种内参基因作为通用的内参基因，可能造成定量不准确甚至出现错误的实验结果。因此，根据实验条件和实验材料筛选合适的内参基因，已成为应用实时荧光定量PCR进行基因组功能分析的重要前提。
[0004] 目前，丝瓜的内参基因仅有18S rRNA基因，其它内参基因的克隆及内参基因稳定性筛选的研究未见报道，因此，在丝瓜逆境胁迫基因表达研究中尚缺合适的内参基因。本发明通过从丝瓜转录组数据获得内参基因EF-1α，利用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对该基因的稳定性进行评价，表明该基因适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下基因表达研究，并用该基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，为后续丝瓜功能基因的精确定量及功能研究奠定基础。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下，用于基因表达研究的一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种丝瓜内参基因EF-1α，所述内参基因EF-1α的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；
其中引物序列为：
正向引物5'- ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC-3'，
反向引物5'- TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT-3'。
[0007]进一步地，以所述内参基因EF-1α的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier 5.0 软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定
量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；
具体引物序列为：
正向引物5'-TCAAGAAGGTCGGATACA-3'，
反向引物5'-ACAGGGACAGTTCCAATAC-3'。
[0008]进一步地，利用所述实时荧光定量PCR引物，采用BestKeeper，GeNorm，NormFinder 和RefFinder分析软件和Delta Ct法对EF-1α基因的稳定性进行评价，表明EF-1α基因在高温、低温和ABA胁迫条件下最稳定，可以作为研究丝瓜高温、低温和ABA胁迫条件下基因表达的内参基因。
[0009]本发明有益效果在于：
本发明公开了一种适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下，基因表达研究的内参基因EF-1α，同时揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物及其应用。本发明的内参基因可在丝瓜响应高温、低温和ABA胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜响应高温、低温和ABA胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。
附图说明
[0010]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0011]图1 是本发明中实施例1的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0012]图2 是本发明中实施例2的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0013]图3 是本发明中实施例2的溶解曲线图。
具体实施方式
[0014]实施例1 丝瓜内参基因EF-1α获得
（1） 从丝瓜转录组数据中获得内参基因EF-1α，采用Primer Premier 5.0设计一对引物，且由铂尚生物技术(上海)有限公司合成该对引物，该对引物为：正向引物5'- ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC-3'，反向引物5'- TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT-3'。[0015]（2） 总RNA提取和cDNA第1链的合成：采用通用植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总R N A。使用The rm o Na no Dro p2000C（The rm o Scientific）测定总RNA浓度和纯度，选择在260/280nm处的吸光度比为1.8-2.0左右的RNA 样品。通过1％琼脂糖凝胶电泳评估总RNA完整性。依据PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，–20℃冰箱保存备用。
[0016]（3） PCR扩增：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
[0017]PCR反应体系：反应总体积为25 μL，包括T3 Super PCR Mix 12.5 μL、正向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、反向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、模板cDNA（100 ng）2 μL和ddH20 8.5 μL。
[0018]PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸60 s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。
[0019]（4）取步骤（3）所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1所示大小
的片段，回收该片段并进行纯化后连接到pMD18-T载体上转化，挑取阳性克隆子，PCR检测后送至测序，所测得的序列即为内参基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：1所示。
[0020]实施例2 引物设计和特异性检测
（1）以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为223 bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示）：正向引物5'-TCAAGAAGGTCGGATACA-3'，反向引物5'-ACAGGGACAGTTCCAATAC-3'。[0021]（2）采用通用
植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总RNA。依据PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，–20℃冰箱保存备用。
[0022]（3）常规PCR检测：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物进行常规PCR扩增反应，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系：反应总体积为25 μL，包括T3 Super PCR Mix 12.5 μL、正向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、反向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、模板cDNA（100 ng）2 μL和ddH20 8.5 μL。[0023]PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸60 s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。
[0024]所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示；由图2可知，PCR 扩增得到一条单一条带，没有发现引物二聚体和非特异性扩增（图2），经测序大小为223 bp，符合预期大小，表明该引物特异性较好、可信度高，可用于qRT-PCR分析。
[0025]（4）qRT-PCR检测：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物进行qRT-PCR扩增反应。利用ABI7500实时定量PCR仪，按照 SYBR® Premix Ex Taq TM试剂盒进行PCR扩增，PCR 反应的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系为：2×SYBR® Premix Ex Taq TM 10 μL，100 ng cDNA 模板2 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，补ddH20至20 μL。
[0026]PCR反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40个循环；延伸阶段收集信号，从60 ℃到95 ℃，采集熔解曲线荧光信号。
[0027]反应的结果如图3（其中ΔRn指荧光强度）所示，从图3可以看出，该内参基因表现出单峰熔化曲线，说明引物具有很高的特异性，并且扩增曲线重复性好，说明qRT-PCR结果准确可靠，可以用于表达稳定性分析。
[0028]实施例3 内参基因EF-1α在高温处理下表达稳定性分析
选择健壮且长势相同的丝瓜幼苗进行42℃高温处理0、2、6、12和24 h，摘取处理后的幼苗叶片立即用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱。提取样品的总R N A，并分别按照PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链。
[0029]以合成的样品cDNA为模板，以7个内参基因（肌动蛋白基因（ACTIN）、α-微管蛋白基因（TUA）、β-微管蛋白基因（TUB）、延伸转录因子（EF-1α）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）、泛素蛋白基因（UBQ）和18S核糖体RNA基因（18S rRNA））的荧光定量引物对(实施例2所述引物对)进行qRT-PCR扩增反应，扩增体系与扩增程序如下：
PCR扩增体系：2×SYBR® Premix Ex Taq TM 10 μL，100 ng cDNA 模板2 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，补ddH20至20 μL。
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