技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地说，本发明涉及一种定点突变、定点修饰的蛋白质及其在制备疫苗，特别是脑膜炎球菌多价疫苗中的用途。 背景技术
脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningococcus,Nm）感染所致的流行性脑脊髓膜炎（流脑），是一种世界范围内致病的急性呼吸道传染病，至今仍严重危害着人类健康，尤其是儿童。脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖结构的差异可分为13个血清，且所有血清均可致病。其中A、B、C、Y、W135脑膜炎奈瑟氏菌所致病约占脑膜炎奈瑟氏菌相关疾病的95%以上。 其中，基于A、C、Y、W135脑膜炎球菌荚膜多糖和多糖-蛋白结合的各种单价（A或C）、双价（A\C）和四价（ACYW135）疫苗，在预防侵袭性疾病、控制疾病流行和爆发中起到了十分关键的作用和理想效果，有效控制了疫苗型疾病的发生。
而B脑膜炎球菌荚膜多糖，由于其包含了与人类抗压潜在交叉免疫的表位，致使其免疫原性很弱，且能诱发自身免疫疾病，因此，以BNm荚膜多糖为免疫原的疫苗研究遇到了严重挑战。
目前国际上针对BNm疫苗的研究主要采用二种策略，一种是基于外膜蛋白的外膜囊泡（Outer Menbrane Vesicle OMV）疫苗，即针对某些特定流行菌株的克隆；另一种是基于反向疫苗学技术的重组蛋白疫苗。 上世纪70年代，美国Zollinger、Frasch等首先报道了B脑膜炎球菌外膜囊泡（OMV）疫苗的研究，随后分别有三种代表性OMV疫苗问世。
1986年，巴西、古巴等南美国家B流脑开始流行，基于古巴流行B脑膜炎球菌Cu385/83菌株（B4：P1.19，15），古巴Finlay研究所研制出VA-ENGOC-BC疫苗，含BOMV、CCPS（荚膜多糖 ）、AL（OH）3佐剂。1989年获得生产许可，1991年纳入免疫规划，已累计接种5500万剂次。
1991年，挪威公共卫生研究所（Norwegian Institute of Public Health，NIPH）采用流行的
B脑膜炎球菌44/76-SL（B15：P1.7,16）为疫苗株，研制出MenBvacTM BOMV疫苗，后转让给凯龙（Chiron）公司，并开始研制及规模化生产。
1991年，新西兰出现B流脑流行，并基于2004-2008年间爆发疾病分离株NZ98/254（CC41/44，B4：P1.7-2.4）研制出B脑膜炎球菌疫苗MeNZB。
2000年，反向疫苗学技术在B脑膜炎球菌疫苗上首次应用成功。该技术主要通过基因重组表达技术，分别克隆表达出fHbp、NadA和NHBA三种蛋白作为BNm蛋白疫苗的候选成分。目前国际上已有两种通过反向疫苗学技术研发的B流脑蛋白疫苗，分别是诺华公司的4C MenB（Bexsero）和辉瑞公司的bivalent fHBp（r-fHBp）。4C MenB（Bexsero）含有FHbp1型蛋白、NadA蛋白和NHBA蛋白，之后又加入新西兰BOMV疫苗（MeNZB）。Bivalent fHBp（r-fHBp）是含有fHbp1型和3型的双价蛋白疫苗。
另外，惠氏公司的rLP2086疫苗，含有单一脂蛋白（rLP2086）的两种重组的脂蛋白LP2086，即两种fHBp重组脂蛋白Subfamily A variant A05和Subfamily B variant01，也是4C MenB的一个组分，试验结果同样显示出能诱导出杀菌抗体。
其他的报道，例如Bruge等曾将纯化BNm荚膜多糖中的乙酰基团用丙酰基团取代，再与载体蛋白结合而制备多糖-蛋白结合疫苗，尽管试验证明该疫苗安全性良好，但诱导的抗体无功能活性。
尽管B脑膜炎球菌疫苗研发历史久远，且已有多个上市或在研产品，仍然存在问题亟待解决。
1、目前尚无国际通用的B脑膜炎球菌OMV疫苗
由于不同国家、地区B流脑流行血清型别、亚型具有明显的地域特征，至今为止开发的OMV疫苗不具有通用性。因而，对于B流脑OMV疫苗的研发，选择适合本地区疾病发病特征的菌株尤为重要。欧洲地区BNm以ST-41/44clonal complex（CC.克隆）血清型15型为主，美洲和大洋洲BNm以ST-8CC、ST-11CC和ST-32CC血清型4型为主。我国流脑监测和Nm分子流行病学研究发现，我国B流行菌型与国外B流行型别不同，主要以ST-4821CC血清型3型为主，并在健康人中大量定植。古巴、挪威、新西兰等国根据本国主要流行的B流脑优势致病株作为疫苗株“定制”的BNm OMV疫苗，所用菌株如下：古巴：VA-MENGOC-BC®疫苗株：Cu385/83（PorA：P1.19，15，PorB：血清型4型）；
挪威：MenBvac TM疫苗株：44/76-SL（PorA：P1.17，16，PorB：血清型15型）；新西兰：MenZB疫苗株：NZ98/254（PorA：P1.7-2.4，PorB：血清型4型）。GSK受让古巴VA-MENGOC-BC®疫苗技术，并将该疫苗推广至其他国家，在不同地区的临床研究保护率各有不同。在1987-1989年，Sierra报道在古巴对106000名10-14岁学生接种2针（间隔6-8周）其保护率为83%；在1989-1990年，Moraes报道在圣保罗进行的于24-47月龄儿童中保护率为47%；在47月龄以上儿童中的保护率为74%；1990-1991年，Moronha报道在里约热内卢进行的多个在47月龄以上儿童中的临床研究显示器保护率为58-74%。1992年在巴西进行的流行病学效果观察，其对4岁以上人的保护率为74%，而对2岁以下人无保护性，由此有学者提出该疫苗对4岁以下儿童缺乏保护作用。该疫苗自1989年被批准使用以来，在古巴、巴西、哥伦比亚、乌拉圭等美洲国家的使用，成功控制了流脑流行，尤其重要的是其中的一些流脑爆发是由不同的B菌株引起的。由Cassio de Moraes开展的实验得出的结论是“这一发现提示，该疫苗能够提供针对一部分B脑膜炎球菌感染的保护作用，而不仅仅是疫苗型菌株”。自1991年起，VA-MENGOC-BC®被列入部分古巴婴幼儿疫苗接种规划中。争论的焦点—对4岁以下人保护作用低的假说，包括伦敦皇家医学院的许多学者、专家论证认为，VA-MENGOC-BC®即使用于婴幼儿接种也能引起适当的免疫应答。
VA-MENGOC-BC®是多年来唯一获得批准的B脑膜炎球菌OMV疫苗，并在主要为拉丁美洲和加勒比海地区的15个国家共接种了约5500万剂，被证明是全球第一个安全、有效的商业化疫苗。随后各国研究的各自“定制”的OMV疫苗，也从中获得了重要经验。但至今仍没有一个国际通用的B脑膜炎球菌OMV疫苗。
2、OMV疫苗的保护覆盖范围的局限性
B脑膜炎球菌根据其PorA和PorB的蛋白分型相当复杂，血清型、亚型间彼此交叉保护性低，因此，有限价数的“定制”疫苗的保护覆盖范围有限。
B脑膜炎球菌OMV中的PorA被确定是一个主要的免疫应答诱导物，并且是血清杀菌抗体的靶点，许多脑膜炎球菌都表达这一蛋白。然而，不同的PorA蛋白具有不同的抗原特异性，因此，一种PorA引起的免疫应答不能对异源PorA抗原的菌株起到防御作用。在美国进行的BNm菌株流行情况调查时发现，将20种不同的PorA蛋白组合起来将会覆盖80%流行菌株。MenB OMV疫苗已成功用于控制疾病的流行、爆发，但其有效性仅局限于控制疫苗型、亚型MenB疾病爆发，对于不同型、亚型MenB引起的疾病，其有效性受限。
3、MenB OMV生产工艺影响其抗原性
至今为止，各国MenB OMV疫苗生产工艺各不相同，导致疫苗成分、含量、纯度及抗原天然构象完整性，均有不同程度的差异和受损。
由于MenB的结构、成分比较复杂，其OMV抗原成分是从菌体细胞膜溶出、纯化而获得的。OMV是一种源自细菌细胞膜的，具有复杂立体构象的多种蛋白成分、LPS等组成的囊泡状结构的多位点抗原复合体，各抗原位点的协同作用而取得更好的免疫效果。
早期的研究过分强调蛋白纯度，而采用了比较复杂的物理、化学相结合的重复工艺，破坏了OMV的天然构象和减弱了丰富的抗原位点，因而影响了疫苗的免疫原性及抗体特异性，致使保护率和免疫持久性不佳。
4、“广谱”的B脑膜炎球菌疫苗（如诺华4C MenB，Bexsero）难以达到广泛保护性
由于OMV疫苗具有所选流行菌株的地域特异性及以上因素的影响，因而难以具有广泛的通用性和有效性，因此，诺华和辉瑞公司基于反向疫苗学技术分别研发了包含多种蛋白成分的B脑膜炎球菌疫苗4C MenB（Bexsero），以期达到更广泛的针对B菌株的覆盖率。
4C MenB（Bexsero）含5种经反向疫苗学技术筛选的经大肠杆菌表达的蛋白抗原，分别为：
fHbp（H因子结合蛋白，最初命名为LP2086）、NHBA（奈瑟菌肝素结合抗原）、NadA（脑膜炎球菌粘附素A），另外两种蛋白为GNA2091和GNA1030，分别与fHbp和NHBA结合形成融合抗原GNA2091-fHbp和GNA1030-NHBA，后又增加了一株新西兰流行菌株（NZ98/254；P1.7-2.4，ST41/44）的BOMV（MeNZB®）组成。
作为一种广谱的B脑膜炎球菌疫苗，4C MenB疫苗对不同BNm的广泛保护性一直备受争议。不同国家流行的代表性B菌株不同，该疫苗中仅含有一种PorA蛋白的OMV，也只是针对P1.7-2.4型的B菌株能产生保护力。不同国家流行的BNm PorA型别不同，4CMenB疫苗PorA菌株覆盖率受不同流行B菌株PorA型别的影响，具有局限性。
4C MenB疫苗中的fHbp为Variant1型，免疫血清对于fHbp Variant1型菌株的有效性可达95%，但是对Variant 2型或3型菌株的保护性仅为56%。美国B致病菌株中35%为Variant 2型或3型。我国B脑膜炎球菌中约90%的菌株为Variant 2型。
此外，4C MenB疫苗中的NadA为主要的抗原成分，但是不同地区流行的B脑膜炎球菌中大部分并不表达NadA，如美国36%的B菌株不含NadA基因，我国超过90%流行的B脑膜炎球菌菌株不含NadA基因。因此，4C MenB疫苗并不适合我国疾病的预防。
总体而言，回顾数十年来各国对BNm OMV蛋白疫苗的研发，临床应用效果显示，在不同地区差异较大，分析原因可能存在以下因素：
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